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目的:观察丰富环境联合重组腺病毒缺氧诱导因子-1ɑ(hypoxia inducible factor-1,HIF-1ɑ)基因对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的影响,探讨二者联合作用的脑保护机制。方法:按随机数字表法将成年雄性SD大鼠随机分为:正常(Normal)组、假手术(Sham)组、脑缺血再灌注(cerebral ischemic and reperfusion,CIR)组、重组腺病毒空载体(recombinant adenovirus vector,Ad)组、重组腺病毒HIF-1α基因治疗(recombinant adenovirus vector containing HIF-1αgene,AdHIF-1α)组、丰富环境干预组(enriched environment intervention,EE)组、丰富环境联合重组腺病毒HIF-1α基因治疗(EE+AdHIF-1α)组,根据再灌注时间的不同,每组又分为脑缺血1h再灌注1d、14d及28d 3个亚组,每个时间点每组18只大鼠。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,分别将无菌生理盐水、Ad及AdHIF-1α注射到各组大鼠缺血侧侧脑室,Ad及AdHIF-1α携带了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)作为示踪标记。在脑缺血1h再灌注1d、14d及28d时取Ad组及AdHIF-1α组大鼠脑组织,于荧光显微镜下观察GFP的表达;对各组大鼠行神经功能缺失体征评分评估大鼠的运动功能,干湿重法测脑组织含水量、苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色观察缺血侧脑组织病理形态改变、TUNEL法检测缺血侧脑组织的细胞凋亡、免疫组化法检测缺血侧脑组织中B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)蛋白的表达、免疫荧光法检测缺血侧脑组织海马CA1区的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)蛋白表达。并于治疗28d后对各组大鼠进行连续5d的Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力,前4d记录大鼠的逃避潜伏期,第5d记录大鼠的跨越平台次数。结果:1.脑缺血再灌注1d时在荧光显微镜下观察到Ad组和AdHIF-1α组大鼠脑组织中有微弱的GFP的表达,14d时荧光信号最强,随后减弱,表达时间约4周,GFP主要分布在大鼠脑组织双侧侧脑室壁、脉络丛及室管膜上皮。2.Normal组及Sham组大鼠神经功能状况良好,行为无异常;CIR组、Ad组、AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组大鼠各时间点均出现行走时转圈或向一侧倾倒等神经功能缺失体征,评分高于Normal组和Sham组(P<0.05);但AdHIF-1α组、EE组与EE+AdHIF-1α组的评分低于CIR和Ad组(P<0.05),且EE+Ad HIF-1α组分别与AdHIF-1α组、EE组相比评分更低(均P<0.05)。3.Normal及Sham组脑水含量随时间变化无改变;脑缺血再灌注1d时,CIR组、Ad组、AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组脑水含量与Normal及Sham组相比明显增加(P<0.05),其中AdHIF-1α组与EE+AdHIF-1α组脑水含量低于CIR组、Ad组及EE组(P<0.05);14d和28d时,AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组脑水含量都低于CIR组和Ad组(P<0.05),且EE+AdHIF-1α组脑水含量分别低于AdHIF-1α组和EE组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.各时间点,光学显微镜下观察Normal组和Sham组脑组织结构正常,神经细胞排列整齐紧密。脑缺血再灌注1d时,CIR组、Ad组、AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组脑组织出现水肿,细胞疏松,缺血中心区神经细胞大小不一,形态异常,排列紊乱;14d时脑组织出现空泡状、拉网状改变,梗死中心区细胞核固缩,核仁消失,神经元数量减少,残留细胞多无完整结构;28d时,AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组缺血侧脑组织病理改变明显减轻,空泡样变减少,神经元脱失减轻,EE+AdHIF-1α组病理损伤程度最轻。5.Normal组和Sham组未检测出凋亡细胞;脑缺血再灌注1d时,CIR组、Ad组、AdHIF-1α组、EE组及EE+Ad HIF-1α组大鼠缺血侧皮质下均检测出凋亡的神经细胞,AdHIF-1α组与EE+AdHIF-1α组神经细胞凋亡数少于CIR组、Ad组和EE组(P<0.05);14d及28d时AdHIF-1α组、EE组及EE+AdHIF-1α组神经细胞凋亡数都少于CIR组和Ad组,且EE+AdHIF-1α组分别与AdHIF-1α组和EE组相比凋亡的神经细胞数更少(均P<0.05)。6.Normal组和Sham组大鼠缺血侧脑组织皮质下未检测出Bcl-2和Bax阳性蛋白;脑缺血再灌注1d时,CIR组、Ad组、AdHIF-lα组、EE组及EE+AdHIF-1α组大鼠缺血侧脑组织皮质下均检测出Bcl-2阳性蛋白,AdHIF-lα组与EE+AdHIF-1α组Bcl-2阳性细胞数明显多于CIR组、Ad组和EE组,差异有统计学意义(P<0.05);14d和28d时,EE组、AdHIF-lα组及EE+AdHIF-1α组Bcl-2阳性细胞数明都多于CIR组与Ad组(P<0.05),且EE+AdHIF-1α组相比EE组、Ad HIF-lα组表达更多(均P<0.05)。脑缺血再灌注1d时各组均检测出Bax阳性蛋白,AdHIF-lα组与EE+AdHIF-1α组Bax阳性蛋白数明显少于CIR组、Ad组和EE组(P<0.05);14d和28d时,EE组、AdHIF-lα组与EE+AdHIF-1α组Bax阳性蛋白数都少于CIR组、Ad组(P<0.05),且EE+AdHIF-1α组分别与AdHIF-lα组及EE组相比表达更少,差异有统计学意义(P<0.05)。7.各时间点,Normal组和Sham组大鼠脑组织海马CA1区BDNF阳性蛋白表达较少,脑缺血再灌注1d时CIR组、Ad组、AdHIF-lα组、EE组及EE+AdHIF-1α组BDNF阳性蛋白表达明显多于Normal组和Sham组(P<0.05);14d及28d时,CIR组、Ad组、AdHIF-lα组、EE组及EE+AdHIF-1α组BDNF阳性细胞数减少,但EE组及EE+AdHIF-1α组BDNF蛋白的阳性表达多于CIR组、Ad组与AdHIF-lα组(P<0.05)。8.Morris水迷宫实验结果显示,与Normal组和Sham组相比较,CIR组、Ad组、AdHIF-lα组、EE组及EE+AdHIF-1α组大鼠的逃避潜伏期延长(P<0.05),跨越平台次数减少(P<0.05);AdHIF-lα组、EE组及EE+AdHIF-1α组的逃避潜伏期较CIR组和Ad组缩短,跨越平台次数增多,且EE+AdHIF-1α组两项成绩均优于AdHIF-lα组和EE组(均P<0.05)。以上各指标Normal组与Sham组间,Ad组与CIR组间相比无统计学差异(均P>0.05)。结论:1.脑缺血再灌注损伤后大鼠缺血侧脑组织中凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白和Bax蛋白大量表达,促进细胞凋亡而导致脑水肿及病理形态学改变,使大鼠的运动和学习记忆能力下降。2.对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠行丰富环境干预早期作用不明显,随着作用时间的延长逐渐发挥脑保护作用。除抑制细胞凋亡外,丰富环境还可能通过上调脑缺血再灌注损伤引起的内源性BDNF的表达而快速启动内源性保护机制。3.AdHIF-lα基因发挥脑保护作用可能与促进抗凋亡蛋白Bcl-2,抑制促凋亡蛋白Bax的表达有关。BDNF蛋白的表达与AdHIF-lα无明显相关性。4.丰富环境与AdHIF-lα基因都能抑制细胞凋亡、减轻缺血脑组织病理损伤、改善大鼠神经功能障碍,且二者联合作用时产生的疗效明显优于各自单独治疗。