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目的:通过检测食管鳞癌患者外周血,正常组织和癌组织中NK细胞的分布、表型及功能;同时检测食管鳞癌组织上清液刺激后的健康人NK细胞表型和功能特征;探讨食管鳞癌微环境对NK细胞表型及功能的影响。方法:第一部分:收集西南医科大学附属医院胸外科52例食管鳞癌患者外周血和手术切除的组织标本,以及健康人外周血35例。采用人淋巴细胞分离液取得外周血单核淋巴细胞;通过一次性多功能研磨过滤器取得组织单细胞悬液。流式细胞仪检测各标本中NK细胞比例,相关受体和功能分子的表达。第二部分:利用磁珠分离器从健康人外周血单核淋巴细胞中负性筛选出NK细胞;将肿瘤组织通过无菌处理后剪成小组织块加入培养基培养24小时,取培养上清液得到肿瘤组织上清液。将健康人NK细胞与肿瘤组织上清液共培养72小时后,流式细胞仪检测NK细胞相关受体和功能分子的表达情况。研究结果:1.食管鳞癌患者标本中NK细胞的分布检测:(1)外周血NK细胞分布情况比较:健康人外周血中NK细胞比例为(16.47±1.10)%,食管鳞癌患者为(18.79±1.33)%,食管鳞癌患者较健康人高,但无明显差异(p=0.1812)。(2)组织标本中NK细胞分布情况比较:食管正常组织中NK细胞百分比为(2.48±0.43)%,食管鳞癌组织中则为(4.10±0.37)%,癌组织明显高于正常组织(p=0.0023),提示食管鳞癌微环境可能刺激了NK细胞增殖。2.食管癌病人标本中NK细胞的表型特征分析:(1)外周血NK细胞表面相关受体表达情况比较:食管鳞癌患者外周血中NK细胞表面活化性受体NKp30(58.19%±4.244%(对照组)VS.52.91%±2.314%(实验组);p=0.2829),NKp46(56.34%±1.187%VS.40.1%±3.296%;p=0.0003),NKG2D(86.15%±1.117%VS.52.06%±2.17%;p<0.0001),CD226(DNAM-1)(94.35%±1.307%VS.86.83%±1.86%;p=0.0086)的表达低于健康人,但NKp44(0.32%±0.04%VS.0.738%±0.103%;p=0.0009)的表达却明显高于健康人;CD16(96.05%±0.572%VS.97.5%±0.4644%;p=0.0556)在两者外周血表达之间无明显差异。抑制性受体NKG2A(22.53±1.34%VS.2.829%±0.3627%;p<0.0001)及CD158b(46.22±3.288%VS.31.75%±2.475%;p=0.0029))两者的表达在健康人中的表达明显均高于食管鳞癌患者,差异具有统计学意义。提示食管鳞癌患者外周血微环境使NK细胞激活。(2)组织标本中NK细胞表面相关受体表达情况比较:活化性受体NKp30(59.68%±4.045%(对照组)VS.42.77%±1.753%(实验组);p=0.0011);NKG2D(51.84%±3.805%VS.37.36%±3.839%;p=0.0045)、CD226(42.2%±3.083%VS.34.02%±2.751%;p=0.0015)、CD16(71.56%±4.903%VS.52.56%±5.872%;p=0.0013)在癌组织中的表达量明显低于正常组织;但NKp44(9.058%±1.334%VS.23.4%±3.331%;p=0.0021)、NKp46(18.67%±1.725%VS.32.5%±1.756%;p=0.0001)在癌组织中的表达却明显高于正常组织。抑制性受体NKG2A(16.66±2.081%VS.15.06%±1.501%;p=0.3769)、CD158b(13.89±1.268%VS.17.74%±1.513%;p=0.0623)表达两者差异无统计学意义。提示食管鳞癌微环境激活了NK细胞同时改变了NK细胞表面受体的表达及减低了CD16介导的细胞毒性。3.NK细胞在食管癌病人标本中的功能特征鉴定:(1)增殖检测:外周血中食管鳞癌患者外周血NK细胞Ki-67(24.35%±2.096%(对照组)VS.60.94%±4.38%(实验组);p<0.0001)表达量明显高于健康人,组织中食管鳞癌组织中NK细胞Ki-67(59.92%±2.513%VS.66.1%±3.11%;p<0.0017)表达量明显高于正常组织;由此说明:食管鳞癌微环境激活了NK细胞,使其增殖能力增强而表现为患者外周血NK细胞数高于健康人,及癌组织浸润的NK细胞数高于正常组织。(2)功能效应分子检测:食管鳞癌患者外周血中Granzyme B(27.95%±4.678%VS.63.5%±7.845%;p=0.0010)表达量明显高于健康人,而Perforin(93.25%±1.18%%VS.93.88%±1.076%;p=0.6996)的表达无差异。组织中Granzyme B(10.45%±1.798%VS.11.68%±1.861%;p=0.5727)、Perforin(85.25%±3.136%VS.80.87%±4.984%;p=0.2800)两者的表达量无明显差异。提示外周血中的NK细胞与组织中NK细胞功能可能存在差异。4.同一患者外周血和癌组织NK细胞表型及功能分析:将同一患者外周血NK细胞和组织中浸润的NK细胞进行配对分析,比较两者分布、表面受体和功能上的差异。结果显示:外周血中NK细胞比例明显高于癌组织(18.79%±1.33%(对照组)VS.4.10%±0.37%(实验组);p<0.0001)。与外周血NK细胞相比较,肿瘤组织中的活化性受体NKp44(0.81%±0.1563%VS.23.51%±3.455%;p<0.0001)表达量升高,但CD16(97.9%±0.436%VS.52.56%±5.872%;p<0.0001)、NKp30(53.53%±2.436%VS.42.93%±1.835%;p=0.0030)、NKp46(40.1%±3.296%VS.32.43%±2.015%;p=0.1020)、CD226(86.27%±2.081%VS.34.02%±2.751%;p<0.0001)、NKG2D(52.06%±2.17%VS.38.15%±3.998%;p=0.0156)在肿瘤组织中表达量均降低;抑制性受体NKG2A(2.967%±0.2716%VS.15.06%±1.501%;p<0.0001)在肿瘤组织中明显升高、CD158b(32.44%±2.554%VS.17.88%±1.6%;p=0.0002)则明显降低。两者功能效应分子表达量情况,结果如下:与外周血相比,肿瘤组织中NK细胞增殖能力无明显变化,ki-67(61.52%±5.243%(对照组)VS.68.16%±3.298%(实验组);p=0.2345),但Granzyme B(65.86%±10.56%VS.11.84%±1.821%;p=0.0021)、Perforin(95.33%±1.159%VS.81.98%±6.12%;p=0.0713)表达量下降。5.健康人NK细胞经肿瘤上清液刺激后表型及功能鉴定:(1)表面受体的检测:经肿瘤上清液刺激后活化性受体NKp30(43.53%±3.487%(对照组)VS.28.84%±2.074%(实验组);p=0.0201);NKp44(19.43%±2.362%VS.12.36%±2.244%;p=0.0699)、NKp46(61.21%±3.446%VS.41.65%±7.605%;p=0.0686)、CD16(83.34%±3.888%VS.69.25%±3.207%;p=0.0490)、CD226(68.6%±2.57%VS.60.09%±2.442%;p=0.0752)、NKG2D(39.78%±4.702%VS.30.56%±5.525%;p=0.1661)表达量均降低;抑制性受体NKG2A(19.24%±4.077%VS.24.18%±5.671%;p=0.0397)表达升高、CD158b(42.51%±3.277%VS.39.02%±2.369%;p=0.1057)表达降低。(2)NK细胞功能相关因子的表达:经肿瘤上清液刺激后ki-67(87.83%±2.404%(对照组)VS.66.71%±2.669%(实验组);p=0.0015)、Granzyme B(51.7%±0.9757%VS.40.69%±4.268%;p=0.0407)、Perforin(96.79%±0.650%VS.83.22%±2.184%;p=0.0004)的表达量均明显下降。说明肿瘤微环境对正常NK细胞进行免疫编辑,使活化性受体和抑制性受体的表达失调,导致其杀伤能力减弱。6.NK细胞比例与食管鳞癌进展的关系:(1)随着肿瘤进展外周血中NK细胞逐渐减少;(2)肿瘤侵袭程度越高肿瘤微环境中浸润的NK细胞越少。结论1.食管鳞癌微环境中的NK细胞仍具有活性;在患者体内食管鳞癌微环境可刺激NK细胞增殖;2.食管鳞癌微环境中的NK细胞受到微环境的影响,活化性受体和抑制性受体的表达失衡;3.食管鳞癌微环境中NK细胞免疫功能效应分子表达减弱,可能导致食管鳞癌细胞发生免疫逃逸;4.外周血与食管鳞癌微环境中的NK细胞比例与肿瘤进展成负相关。