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目的本研究采用的链球菌xiaochunlingii E24菌株,是从健康儿童口咽部定植的菌群中筛选出潜在的益生菌菌株。这些菌株是来自于呼吸道的优势菌群,对常用抗生素敏感,具有体外抑菌的特性,经过冻存、复苏后仍具有稳定性。经鉴定其属于链球菌新种,命名为xiaochunlingii链球菌。本课题建立细胞模型和动物模型,探讨潜在益生性链球菌E24对大气污染物PM2.5(Particulate Matter 2.5)暴露所导致的对人支气管上皮16-HBE细胞和BALB/c小鼠呼吸道损伤保护作用的相关研究。通过体内和体外实验探索益生性链球菌对大气污染物PM2.5暴露引起的炎症反应和呼吸道微生态菌群的改变。方法1.收集PM2.5冻干粉,制备不同浓度(12.5、25、50和100μg/ml)的PM2.5混悬液,分别暴露于人支气管上皮16-HBE细胞6、12、24和48h,使用CCK-8试剂盒检测细胞活力,确定PM2.5的暴露浓度和时间。选取50和100μg/ml的PM2.5分别暴露16-HBE细胞24h,ELISA检测细胞培养上清液炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。Western blot检测16-HBE细胞暴露PM2.5后Nrf2、IKK-α、P65、Cyclin A2、Cyclin D等蛋白的表达量。2.BALB/c小鼠随机分为对照组和PM2.5暴露组,用浓度为750μg/m~3的PM2.5混悬液染毒小鼠,每天暴露4小时连续染毒4周,收集小鼠血清用于检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,采集小鼠气管组织检测Nrf2、IKK和P65表达含量。3.链球菌xiaochunlingii E24对暴露过PM2.5的16-HBE细胞的影响,收集细胞培养上清液用于炎性因子水平的检测。提取细胞蛋白Western blot检测16-HBE细胞暴露PM2.5后Nrf2、IKK和P65表达水平的变化。4.BALB/c小鼠随机分为对照组、PM2.5暴露组、E24菌株保护组和E24菌株治疗组。实验组小鼠暴露于PM2.5环境中,每天4小时,连续15天。E24菌株保护组在染毒之前E24菌株悬液8天,E24菌株治疗组在PM2.5染毒后E24菌株悬液8天。对照组动物用相似的饲养条件,使用生理盐水进行每日4小时暴露处理。采集小鼠咽拭子用于高通量测序结果分析;采集小鼠气管,观察其病理学改变;并对小鼠血清中的炎性因子水平进行评估,探讨潜在益生性链球菌xiaochunlingii E24对PM2.5诱导呼吸系统损伤的影响。结果1.CCK-8检测结果表明PM2.5能够诱导16-HBE细胞活力下降,并且随PM2.5作用浓度和时间的增加而下降;ELISA结果显示,PM2.5暴露16-HBE细胞后,能够导致细胞炎性因子水平升高;Western检测结果表明,PM2.5能够导致细胞周期和炎症相关蛋白表达升高。2.经PM2.5暴露后,小鼠血清炎症因子水平表达升高,小鼠气管氧化应激和炎症相关蛋白表达升高,病理组织形态学观察结果也表明PM2.5能够诱导小鼠气管组织发生明显的炎症反应。3.链球菌E24菌株作用16-HBE细胞后,能够降低PM2.5诱导的细胞损伤,且E24菌株对PM2.5诱导的细胞氧化应激和炎症损伤具有一定的保护作用。4.链球菌E24菌株处理组小鼠和E24菌株保护组小鼠血清炎性因子表达水平较PM2.5暴露组小鼠呈降低趋势,且Western blot检测结果表明E24菌株处理组小鼠和E24菌株保护组小鼠气管炎症相关蛋白表达下调,链球菌xiaochunlingii E24的使用能够降低PM2.5诱导的小鼠气道炎症损伤,并且对小鼠呼吸道菌群具有一定的调节作用。结论1.PM2.5暴露能诱导16-HBE细胞周期表达下调炎症反应和氧化应激相关蛋白表达升高,诱导BALB/c小鼠气管发生炎性损伤。2.潜在益生性链球菌xiaochunlingii E24的处理对PM2.5诱导的16-HBE和小鼠呼吸道损伤具有一定的保护作用。大气PM2.5的暴露对小鼠呼吸道的菌群丰度及多样性造成改变,E24菌株的处理对PM2.5诱导的的菌群失调具有一定的调节作用。