目的:1，2-二氯乙烷(Dichloroethane，1，2-DCE)是工业上常用的有机溶剂，主要用于粘合剂的稀释剂。1，2-DCE为无色、易挥发、具有氯仿气味的油状液体，属高毒类。中毒性脑病是亚急性1，2-DCE职业中毒的主要临床表现，脑水肿为其主要的病理改变过程。迄今为止，有关亚急性1，2-DCE中毒性脑水肿机制的研究资料很少，亟待进行深入研究。1，2-DCE在人和动物体内主要经细胞色素P4502E1代谢生成2-氯乙醇和氯乙醛，它们具有比1，2-DCE更强的毒性，在1，2-DCE引起的毒效应机制中发挥重要作用。因此，探讨2-氯乙醇直接导致的神经毒性效应尤为必要。脑水肿分为细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿，星形胶质细胞（astrocytes，AS）水肿是其早期病理过程中最突出的特征。AS是中枢神经系统内数量最多的细胞群体，不仅对神经元起支持和营养作用，而且参与血脑屏障的诱导与维持及细胞外环境稳态的调控等。当血液中外来化学物质进入脑组织时，AS应是其初始蓄积并损伤的主要靶细胞。传统的脑水肿形成机制学说包括“能量代谢障碍”、“氧自由基损伤”、“神经递质兴奋性毒性损伤”及“血脑屏障损伤”等。近年来，随着人们对脑水肿机制研究的不断深入，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表达异常及其调控机制在血管源性脑水肿形成和发展过程中的作用受到了广泛的关注。本研究拟通过体外细胞毒理学试验研究，以原代培养AS为研究对象，探讨2-氯乙醇对AS线粒体功能和谷氨酸代谢的影响，以及MAPK信号通路对2-氯乙醇诱导AS中MMP-2和MMP-9表达的调控作用，从细胞毒性和血管源性脑水肿两个层面深入研究2-氯乙醇对AS的损伤及其在脑水肿发生机制中的作用，为揭示1，2-DCE中毒性脑水肿的发生机制提供新的研究方向和实验参考数据。　　方法:1、取出生1-3天Wistar仔鼠，取大脑皮质剪碎，胰酶消化使细胞分散，将细胞悬液接种于培养皿中，差速贴壁去除成纤维细胞，经传代纯化后，GFAP染色法鉴定纯度。2、用灭菌后的去离子水配制成1 M(mol/L)2-氯乙醇储备液。使用前，将2-氯乙醇储备液用培养液稀释，用含5％胎牛血清的DMEM培养液制备成含不同2-氯乙醇浓度的培养液。以2-氯乙醇为染毒物，第一部分2-氯乙醇对AS的损伤研究共分为4组，培养液中含2-氯乙醇浓度分别为0、7.5、15和30 mM，培养24 h。倒置显微镜观察细胞形态及生长状态并采集图像，AlamarBlue法检测细胞活力，应用试剂盒检测细胞内还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、一氧化氮(nitricoxide，NO)、乳酸、ATP和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)含量，诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、caspase-9、caspase-3和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性，线粒体膜电位、线粒体膜通透性转换孔状态。采用免疫荧光化学染色法检测AS中GLAST、GLT-1和GS的蛋白表达。采用Western Blot和Real time RT-PCR法分别检测Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、caspase-9、caspase-3、iNOS、GLAST、GLT-1和GS蛋白和mRNA的含量。3、第二部分MAPK信号通路对2-氯乙醇诱导AS中MMP-2和MMP-9表达的调控作用的研究分三方面，首先，采用免疫荧光化学染色法检测AS中MMP-2和MMP-9的蛋白表达，Western Blot和Real time RT-PCR法分别检测MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达水平。其次，将细胞随机分7组:对照组（包括空白对照组、溶剂对照组和抑制剂对照组）、暴露组和干预组（包括低、中和高剂量抑制剂预处理组）。暴露组细胞培养液中2-氯乙醇浓度为30 mM，暴露24小时。三种信号通路干预组细胞分别接受其特异性抑制剂处理一小时后，按上述暴露组细胞处理方法暴露24小时。收集细胞检测p38、ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达水平，检测磷酸化p38(p-p38)、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化JNK1/2(p-JNK1/2)的蛋白含量。最后，探讨过氧化物清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对2-氯乙醇诱导ROS的生成以及MAPK活化过程的影响。将细胞随机分为5组，分别为对照组、暴露组和干预组（包括低、中和高剂量NAC预处理组）。暴露组细胞处理方法同上。干预组细胞分别经5、50和500μM NAC预处理。一小时后，干预组细胞按上述暴露组细胞处理方法，暴露24小时后，收集细胞分别检测细胞内ROS水平，以及p-p38、p-ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白含量。4、统计分析采用SPSS20.0软件进行。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)检验。检验水准为P＜0.05。　　结果:1、2-氯乙醇对AS的毒性损伤研究结果显示，随暴露剂量增大，AS脱壁增多，细胞间隙增大，细胞数量逐渐减少。各2-氯乙醇暴露组的细胞活力随暴露浓度的升高而下降。15和30mM2-氯乙醇暴露组AS中GSH含量显著低于对照组，相反，NO含量、iNOS的活性、蛋白以及mRNA的含量显著高于对照组。各浓度2-氯乙醇暴露组AS中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性和蛋白含量显著低于对照组(P＜0.05)，而各组间Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的mRNA表达水平差异无统计学意义。2、本研究中线粒体功能由细胞内乳酸含量、ATP含量、ROS含量、mPTP开放状态、线粒体膜电位以及caspase-3/9的表达进行评价。15和30 mM2-氯乙醇暴露组AS中乳酸和ROS含量显著高于对照组，各浓度2-氯乙醇暴露组AS中ATP含量均显著低于对照组（P＜0.05）。各2-氯乙醇暴露组的线粒体膜电位显著低于对照组，15和30 mM2-氯乙醇暴露组AS中mPTP开放明显（P＜0.05）。15和30 mM2-氯乙醇暴露组的裂解caspase-9和caspase-3的蛋白含量显著高于对照组和7.5 mM2-氯乙醇暴露组。此外，30 mM2-氯乙醇暴露组的caspase-9和caspase-3酶活性显著高于对照组和7.5 mM2-氯乙醇暴露组。各组的caspase-9和caspase-3mRNA表达水平之间差异无统计学意义。3、随染毒剂量增加，GS、GLAST和GLT-1的荧光强度逐渐减弱。15和30mM2-氯乙醇暴露组GS的酶活性和蛋白含量显著低于对照组，30 mM2-氯乙醇暴露组GS的mRNA表达水平显著低于对照组(P＜0.05)。30mM2-氯乙醇暴露组GLAST和GLT-1的蛋白含量显著低于其他组，15和30mM2-氯乙醇暴露组GLAST的mRNA表达水平显著低于对照组(P＜0.05)，各组间GLT-1的mRNA表达水平差异无统计学意义。4、随2-氯乙醇暴露剂量的增加，各暴露组AS中MMP-2和MMP-9的荧光强度逐渐增强，15和30 mM2-氯乙醇暴露组MMP-9的蛋白含量显著高于对照组和7.5 mM2-氯乙醇暴露组(P＜0.05)。30mM2-氯乙醇暴露组MMP-9的mRNA表达水平显著高于其他各组，仅30 mM2-氯乙醇暴露组MMP-2的蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05）。5、与空白对照组相比，抑制剂对照组AS中p38、p-p38、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、MMP-2和MMP-9的蛋白含量显著下降，而它们在暴露组中的蛋白含量显著上升(P＜0.05)。而且与暴露组相比，各剂量SB202190抑制剂组AS中的p-p38以剂量依赖方式下降，中高剂量SB202190抑制剂组AS中的MMP-2和MMP-9的蛋白含量亦随之显著下降(P＜0.05)。除低剂量U0126和SP600125抑制剂组中的p-ERK1/2和p-JNK1/2之外，其各自两组抑制剂组中p-ERK1/2、p-JNK1/2和MMP-9的蛋白含量显著低于暴露组(P＜0.05)。三个SP600125抑制剂组的MMP-2的蛋白含量显著低于暴露组(P＜0.05)。另一方面，与空白对照组相比，三个抑制剂对照组AS中MMP-9的mRNA表达水平显著下降，而暴露组却显著上升(P＜0.05)。此外，中高剂量SB202190抑制剂组AS中MMP-9的mRNA表达水平显著低于暴露组（P＜0.05）。而且高剂量SB202190抑制剂组的MMP-9的mRNA表达水平显著低于中剂量SB202190抑制剂组（P＜0.05）。高剂量U0126和SP600125抑制剂组的MMP-9的mRNA表达水平显著低于低剂量U0126和SP600125抑制剂组（P＜0.05）。然而，各处理组间p38、ERK1、ERK2、JNK1和JNK2的mRNA表达水平无统计学差异。6、暴露组中细胞内ROS的含量显著高于对照组，而NAC干预组的ROS含量显著低于暴露组。高剂量NAC干预组AS中p-p38以及三组NAC干预组AS中p-JNK1/2的蛋白含量显著低于暴露组(P＜0.05)。NAC干预组AS中p-ERK1/2的蛋白含量无统计学差异。　　结论:1、2-氯乙醇暴露对AS产生毒性效应并导致线粒体功能障碍和谷氨酸代谢紊乱，最终引起细胞毒性脑水肿。2、2-氯乙醇暴露使AS中MMP-2的蛋白含量、MMP-9的蛋白和mRNA表达水平上升。3、MAPK信号通路的激活对2-氯乙醇诱导AS中MMP-2和MMP-9表达上调起重要作用。4、2-氯乙醇暴露使ROS含量增多，增多的ROS可介导2-氯乙醇暴露后AS中MAPK信号通路的活化。