论文部分内容阅读
我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣（麦秸、玉米秸秆）等就约6亿t,其富含木质纤维素。应用食用菌转化秸秆、变废为宝是一条成功的途径。为提高食用菌利用木质纤维素的能力,提高食用菌对秸秆的生物学效率,本文以平菇天达300为材料,构建了高效遗传表达体系,并进行了漆酶基因转化。研究结果如下:（1）平菇sdi启动子的克隆及表达载体25号的构建和转化克隆了平菇天达300的同源启动子-1.3kb的sdi启动子,利用重叠PCR将sdi启动子片段和潮霉素抗性基因hph融合,构建了以pMD19-T载体为骨架,含有sdi启动子和hph以及CaMV终止子的表达载体25号。以液体培养的平菇菌丝为实验材料,0.6mol/L甘露醇作渗透压稳定剂,浓度为1.6%的溶壁酶溶液,30℃酶解3h,获得具有再生活力的原生质体。平菇天达300原生质体的得率约为5.7×106个/mL,在RCM再生平板上的再生率为0.46%。通过平菇的潮霉素抗性试验,确定了其菌丝和原生质体的潮霉素致死浓度。据此将转化的初筛浓度定为80μg/mL,复筛浓度定为100μg/mL。采用PEG-CaCl2介导原生质体转化的方法,将表达载体25号转化入平菇,在含80μg/mL潮霉素RCM平板上,获得一系列转化子。这些转化子经过复筛和PCR鉴定后得到潮霉素抗性基因hph整合入宿主基因组的阳性转化子。将阳性转化子菌株进行表型和RNA转录水平验证,表明hph基因整合入平菇的基因组,其抗性可以稳定的遗传和表达,从而建立了平菇的遗传转化体系。（2）食用菌不同转化体系转化效率的比较将两个含有潮霉素抗性基因但启动子不同的真菌表达质粒pAN7-1和PBHt1,导入平菇中与25号做比较表明,不同的启动子得到的抗性转化子生长速率、转化率、RNA水平上的转录都不同。pAN7-1抗性转化子转化率最高,0.4个转化子/μg质粒DNA,其hph目的基因的表达量最大;其次是25号抗性质粒,0.2个转化子/μg质粒DNA;PBHt1的表达量较少。（3）平菇漆酶基因poxc的克隆和同源表达利用RT-PCR和LA PCR步行等技术从平菇天达300中获得编码漆酶基因poxc的gDNA和cDNA。gDNA全长为3818bp,包含19个内含子和20个外显子。cDNA序列全长为1607bp,编码533个氨基酸的蛋白,与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,并且含有3个真菌类Cu-oxidase的高度保守结构域。构建了含有sdi启动子和poxc基因的同源表达载体PIPOXC和PI2POXC,和25号抗性表达载体共转化平菇的原生质体,获得了具有潮霉素抗性的假定转化子21个,但是经PCR检测后发现poxc基因未完全整合入平菇基因组,漆酶酶活提高不明显,没有筛选到预期的漆酶活性较高的转化子。