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造血干细胞诱导分化是干细胞领域研究的热点,探索不同来源的干细胞进行造血分化的研究及研究相关因子对造血分化的影响是目前干细胞领域实现临床转化的重要基础。已有研究发现,EZH2在胚胎早期发育及中胚层发育中起着重要作用,提示该基因可能参与造血分化的相关过程。目的:观察EZH2在不同类型地贫hiPS细胞系中的表达情况;探求EZH2在hESC/hiPSC造血分化中的作用。方法:本实验室建立了人ES细胞及人iPS细胞诱导分化的技术平台,在此基础上结合EZH2在造血分化功能方面的研究,并结合地中海贫血的细胞株进行了进一步的探索。H1为正常人ES细胞,是从囊胚内细胞团分离而来,AF888是羊水细胞来源的正常人iPS细胞,同时针对海南区域性遗传病地中海贫血,还建立了4株不同突变类型的地贫iPS细胞系,包括轻度β地贫hiPS细胞系AF038、AF806,重度β地贫hiPS细胞系AF077、AF884。为研究EHZ2在造血分化中的作用,在上述hESC/hiPSC中采用Crispr/Cas9技术建立EHZ2基因敲除细胞株,采用慢病毒感染建立EHZ2基因过表达细胞株,并通过q RT-PCR及Western Blotting的方法验证EZH2基因敲除、过表达情况。通过拟胚体途径诱导上述hESCs/hiPSCs向造血分化,分别收集d0、d4、d8、d12、d16天的拟胚体,通过q RT-PCR检测多能性基因OCT4、SOX2、NANOG及内、中、外三胚层标记基因GATA4、MSX1、PAX6的变化情况,然后通过流式细胞仪检测以上不同天数EBs中CD34+-CD43+、CD34+、CD43+的比率。结果:通过qRT-PCR在mRNA水平检测正常hESC/hiPSC及不同地贫类型的hiPSC共6株细胞的野生型细胞株中EZH2的表达情况,以正常的ES细胞为对照,结果显示在重度地贫hiPSC中EZH2表达下降;并在上述6个细胞系中建立稳定敲除和过表达EZH2基因的细胞株。通过拟胚体途径诱导上述hESC/ hiPSCs向造血分化,在d0-d8的拟胚体（EBS）采用悬浮培养,EBS在制备24h后便开始自发聚集形成球状。d8开始将EBS进行贴壁培养,将EBs接种在预先用Matrigel包被的培养皿,镜下可见EBs贴壁后呈克隆样生长,随着培养时间的延长,可见贴壁后的EBs发生分化。 正常ESC/iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。H1与AF888相比,干性维持方面,在H1中敲除EZH2基因可增强干性的维持,而在AF888中敲除EHZ2后则抑制干性的维持;在H1中过表达EZH2基因可仍表现为促进干性维持,而在AF888中过表达EHZ2基因后对干性表现出抑制作用。三胚层分化方面,在H1中敲除EZH2基因可促进向内胚层和外胚层的分化,而抑制中胚层的分化,而在AF888中敲除EHZ2后对向内、中、外三胚层的分化均表现为促进作用;在H1中过表达EZH2基因变现为抑制向内、中、外三个胚层的分化,在AF888中过表达EHZ2基因后向内中外三给胚层的分化同样表现为抑制作用。 轻度地贫iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。AF806与AF038相比,干性维持方面,在AF806中敲除EZH2基因可增强干性的维持,而在AF038中敲除EHZ2后在分化早期促进干性的维持随着分化时间的延长,促进作用减弱;在AF806中过表达EZH2基因可仍表现为促进干性维持,而在AF038中过表示EHZ2基因后对干性表现除抑制作用。三胚层分化方面,在AF806中敲除EZH2基因可促进向中胚层和外胚层的分化,而抑制内胚层的分化,而在AF038中敲除EHZ2后可促进向内胚层的分化,而抑制向中胚层、外胚层分化。在AF806中过表达EZH2基因可仍表现为抑制向内胚层的分化,促进向中胚层、外胚层的分化,而在AF038中过表示EHZ2基因后这促进向内胚层、外胚层分化,抑制向中胚层分化。重度地贫iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。AF077与AF884相比,干性维持方面,在077中敲除EZH2基因后增强干性的维持,而在AF884中敲除EHZ2后也表现为增强干性的维持;在077中过表达EZH2基因在分化早期仍表现为促进干性维持,随着分化的进行,这种促进作用消失,而在AF884中过表示EHZ2基因后促进干性维持。三胚层分化方面,在AF077中敲除EZH2基因可促进向内、中、外胚层的分化,而在AF884中敲除EHZ2后也表现为促进向内、中、外三胚层的分化。在AF077中过表达EZH2基因对向内、中、外三个胚层的分化仍有促进作用,但该促进作用较AF077-EZH2-KO弱,在AF884中过表示EHZ2基因后向内中外三给胚层的分化同样表现为促进作用,但该促进作用较AF884-EZH2-KO弱。通过流式细胞仪检测以上不同天数EBs中CD34+-CD43+、CD34+、CD43+的比率。在H1中,H1-WT、H1-EZH2-KO、H1-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,变化都呈先增加后降低的趋势。H1-EZH2-KO与对应天数H1-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD43+细胞比率（因d0时无造血出现）d4的相对比分别为0.28、0.52,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐增加的趋势,d16的相对分化比为2.03、2.81,CD34+细胞比率相对变化趋势先增加,d12出现峰值,相对比为34.29,随后降低。H1-EZH2-OE与对应天数H1-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率相对比在d4时分别为:0.17、0.40、0.27,随分化时间的延长,呈先增加后缓慢减低的相对变化趋势,峰值出现在d12,相对变化比分别为1.66、3.59、1.96。（见图3.10、表3.7）在AF888中AF888-WT、AF888-EZH2-KO、AF888-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,变化都呈先增加后降低的趋势。AF888-EZH2-KO与对应天数AF888-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率整体均增高,d4时相对比分别为1.16、1.45、1.31,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐增加的变化趋势d16时相对比分别为2.07、2.03、2.5。AF888-EZH2-OE与对应天数AF888-WT诱导的EBs相比CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率整体增加,d4时相对比分别为3.04、7.07、1.63,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐将降低的趋势,d16先对比分别为1.31、1.26、1.45。（见图3.10、表3.8）AF806与AF038均为轻度地贫患者羊水来源细胞诱导的iPS细胞系。在AF806中AF806-WT、AF806-EZH2-KO、AF806-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,变化都呈先增加后降低的趋势,峰值均出现在d12。AF806-EZH2-KO与对应天数AF806-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率整体均减低,相对变化均呈逐渐降低的变化趋势,d4时相对比分别为0.41、0.71、0.35,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐将降低的趋势,d16相对比分别为0.17、0.17、0.18。AF806-EZH2-OE与对应天数AF806-WT诱导的EBs相比CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率整体均减低,其中CD34+-CD43+、CD34+细胞比率d4时相对比分别为0.76、0.83,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐将降低的趋势,d16相对比分别为0.33、0.33;CD43+的相对变化呈波动性变化,峰值出现在d8,相对比为0.55。在AF038中AF038-WT、AF038-EZH2-KO、AF038-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,其中AF038-WT、AF038-EZH2-OE诱导的EBs变化都呈先增加后降低的趋势,峰值均出现在d8;AF038-EZH2-KO诱导的EBs中CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率随分化时间的延长逐渐增加。AF038-EZH2-KO与对应天数AF038-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率在d4-d12整体均减低,d12-d16整体增加。d4时相对比分别为0.42、0.49、0.53,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐将增加的趋势,d16相对比分别为4.64、3.77、4.78。AF038-EZH2-OE与对应天数AF038-WT诱导的EBs相比CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率整体均降低。d4时相对比分别为0.07、0.07、0.1,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐增加的变化趋势,d16先对比分别为0.88、0.71、0.95。AF077与AF884均重度地贫iPS细胞系。在AF077中AF077-WT、AF077-EZH2-KO、AF077-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,呈逐渐增加的趋势,在d4-d16期间均无明显峰值。AF077-EZH2-KO与对应天数AF077-WT诱导的EBs相比,CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率呈先降低后增加的相对变化趋势,d4的相对比分别为:1.47、1.51、1.09,波谷在d12分别为:0.75、0.42、0.45。AF077-EZH2-OE与对应天数AF077-WT诱导的EBs相比CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率在d4-d12整体均降低,d12后d4-d12整体均升高。d4时相对比分别为0.21、0.17、0.55,随分化时间的延长,相对变化呈逐渐增加的变化趋势,d16相对比分别为1.11、1.14、1.11。在AF884中AF884-WT、AF884-EZH2-KO、AF884-EZH2-OE诱导的EBs中在d4均可检测到CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞的出现,其中AF884-WT呈逐渐增加的趋势,AF884-EZH2-KO、AF884-EZH2-OE呈先增加后减低的变化趋势。AF884-EZH2-KO与对应天数AF884-WT诱导的EBs相比,CD34+、CD43+、CD34+-CD43+细胞比率呈先增加后将低的相对变化趋势,其中CD34+-CD43+的峰值出现在d12,相对比为2.36,CD34+、CD43+的峰值出现在d8,相对比分别为:2.09、2.24。AF884-EZH2-OE与对应天数AF884-WT诱导的EBs相比CD34+-CD43+、CD34+、CD43+细胞比率均呈先增加后降低的相对变化趋势,峰值出现在d8相对比分别为1.52、1.49、1.42。结论:1、发现EZH2基因在不同类型地贫hiPS细胞系中表达存在差异,在重度地贫中明显下降;2、EZH2基因在干细胞株干性因子的表达方面有促进作用;3、EZH2基因敲除有助于各胚层相关因子的表达;4、EZH2对干细胞干性维持及分化的调控中存在剂量效应,并有待通过实验结果进一步验证;5、胚胎干细胞与成体诱导多能干细胞在干性因子的表达和各个相关胚层的表达及造血分化潜能等方面对EZH2的剂量变化呈现不同的变化趋势,提示二者在干性维持和分化诱导方面有所不同;6、携带有不同突变类型的地中海贫血成体诱导多能干细胞在干性因子和各个相关胚层的表达及造血分化潜能等方面对EZH2的剂量变化呈现不同的变化趋势,而且不同突变类型的细胞株的表型也不尽相同,具体机制还有待进一步分析;7、建立不同类型的干细胞株,特别是携带不同疾病突变类型的干细胞株有重大意义,可以作为研究疾病的模型,具有临床转化应用价值。