【摘 要】
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研究背景群体感应能通过调控细菌间的相互通讯,调节细菌生物膜发育和成熟。N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acyl homoserine lactone,AHL-lactonase）是一种群体感应淬灭酶,能降解群体感应相关的信号分子并干扰细菌的群体感应系统。目前,已经有很多研究报道了AHL-lactonase能够抑制多种细菌的生物膜形成,被认为是预防和治疗细菌感染性疾病又不引起耐药性的一种新型抗菌方法,但
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研究背景群体感应能通过调控细菌间的相互通讯,调节细菌生物膜发育和成熟。N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acyl homoserine lactone,AHL-lactonase）是一种群体感应淬灭酶,能降解群体感应相关的信号分子并干扰细菌的群体感应系统。目前,已经有很多研究报道了AHL-lactonase能够抑制多种细菌的生物膜形成,被认为是预防和治疗细菌感染性疾病又不引起耐药性的一种新型抗菌方法,但其在调控口腔细菌生物膜形成方面的作用仍有待探究。因此,本研究旨在探究AHL-lactonase est816对伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans）生物膜形成和毒力因子产生的影响,并研究其对牙周炎进展的影响。方法6,12和24U/ml的est816与A.actinomycetemcomitans悬浮液分别共培养48h后形成生物膜,通过结晶紫染色,激光共聚焦和扫描电镜分别检测est816对生物膜量和生物膜结构的影响;对A.actinomycetemcomitans生物膜的毒力因子,如胞外多糖（extracellular polysaccharide,EPS）的产生及白细胞毒素（leukotoxin,lkt A）,细胞致死膨胀毒素（cytolethal distending toxin,cdt A）的表达分别采用苯酚硫酸法和实时定量PCR。CCK-8和死活染色法检测est816对人牙龈成纤维细胞增殖的影响,确定是否具有生物相容性;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测est816能否抑制生物膜上清刺激引起的炎性因子表达。体内实验,通过丝线结扎法建立大鼠牙周炎模型,将大鼠分为对照组（不结扎+生理盐水）,A.a组（结扎+A.actinomycetemcomitans菌液）和est816+A.a组（结扎+A.actinomycetemcomitans菌液+est816）,分别在1和2个月时取上颌骨进行微型计算机断层扫描（Micro-computed tomography,Micro-CT）,2个月时行HE和免疫组化染色,评估各组大鼠牙周炎的炎症程度,16S r RNA检测2个月时各组结扎区牙龈组织中的菌群差异。结果1.结晶紫染色,激光共聚焦和扫描电镜结果显示,各浓度的est816均能显著抑制A.actinomycetemcomitans生物膜的形成（P＜0.01）,且呈浓度依赖性;2.est816均能有效抑制A.actinomycetemcomitans生物膜毒力因子的产生,如EPS,lkt A和cdt A（P＜0.05）;3.CCK-8和死活染色结果证明6和12 U/ml的est816对人牙龈成纤维细胞的增殖和活力没有影响,其具有良好的生物相容性;4.ELISA结果表明est816处理后的生物膜上清对细胞的刺激性减弱,12h时肿瘤坏死因子α和白介素6的表达降低（P＜0.05）。5.Micro-CT和HE染色显示est816+A.a组显著降低大鼠牙槽骨的吸收和牙周炎症反应,同时免疫组化证明est816下调了牙槽骨中与骨吸收相关的信号分子NF-κB配体的受体激活剂和基质金属蛋白酶-9的表达,而骨保护素的表达被上调。16S r RNA基因测序显示,与对照组相比,A.a和est816+A.a组的牙龈组织中的菌群结构均发生变化,但A.a组的差异更明显。结论1.AHL-lactonase est816能有效地抑制A.actinomycetemcomitans生物膜的形成和毒力因子产生;2.est816能抑制A.actinomycetemcomitans生物膜引起的细胞炎症反应且具有生物相容性;3.est816能抑制大鼠牙周炎的进展。综上所述,AHLlactonase est816有期望作为预防和治疗牙周炎的潜在替代药物,并为抗生素耐药性问题提出新策略。
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