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【背景】乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，据统计，全世界每年约有135万的乳腺癌患者，其中54万为新发病例，而每年约有50万人死于该病1。而HER2是乳腺癌中常见的过表达蛋白，在侵润性乳癌中高达20%，HER2相关信号通路的激活可导致细胞增殖失控，容易发生侵袭和转移，同时对抗肿瘤药物的敏感性降低，预后差2。所以针对HER2的靶向治疗成为近年来研究的热点。Herceptin (trastuzumab，商品名：赫赛汀）是抗HER2的人源化单抗，目前已广泛用于HER2阳性乳腺癌患者的治疗中3。而Herceptin耐药经常在用药一年左右出现4，往往使得治疗失败，导致乳腺癌患者预后较差，5年生存率不到40%5。因此，阐明Herceptin耐药的机制势在必行。近年来的研究表明，多种miRNA与乳腺癌的发生、发展、侵袭以及转移和Herceptin耐药密切相关6。在乳腺癌细胞中，微小RNA(miRNA)的表达异常可导致多种基因表达紊乱，与细胞的耐药性密切相关7。因此，深入探究乳腺癌中miRNA的表达及其与乳腺癌发生、发展和耐药的关系成为当今研究热点。，在对乳腺癌Herceptin耐药的研究中，我们建立了HER2阳性乳腺癌耐药细胞系，采用miRNA芯片、QRT-PCR等策略，成功筛选并鉴定出一系列耐药相关的miRNA，其中miR-375是差异表达最明显的miRNA之一，推测miR-375有可能参与HER2阳性乳腺癌耐药。它作为一个已经报道过的肿瘤抑制分子，已经被证实在许多恶性肿瘤中出现下调8，这个miRNA于2004年，在小鼠胰腺细胞株中被首次发现了9，迄今为止，已经在肝癌9、胃癌10、宫颈癌11、卵巢癌12、头颈部13等多个实体肿瘤中检测出低表达，并验证出其表达量的升高可以抑制这些肿瘤细胞的恶性表型。又由于miR-375具有许多调控细胞增殖，凋亡，细胞周期，以及转移的相关基因结合位点。因此，我们认为深入研究miR-375在HER2阳性乳腺癌耐药中的作用和机制，具有非常重要的意义，有可能为临床逆转HER2阳性乳腺癌耐药提供新的思路和靶标。【目的】从多水平多角度研究miR-375在HER2阳性乳腺癌耐药中的作用，并初步探讨其可能的分子机制。【方法】1、通过Herceptin药物压力筛选HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3的方法建立稳定的HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3耐药细胞株；2、利用软琼脂克隆形成、侵袭实验等方法检测SK-BR-3耐药细胞株（SK-BR-3R）与亲本株（SK-BR-3P）相比的生物学特性；3、利用miRNA芯片筛选、QRT-PCR验证的方法筛选出差异表达的miRNA；4、构建miR-375前体的过表达载体，并分别感染和转染SK-BR-3R和SK-BR-3P细胞，通过QRT-PCR检测感染和转染后细胞中miR-375的表达量；5、MTT方法检测感染和转染后细胞对Herceptin药物的敏感性；6、通过流式细胞术分析miR-375对乳腺癌细胞凋亡的影响；7、通过划痕实验、侵袭实验验证miR-375在细胞迁移、侵袭中的作用；8、建立裸鼠成瘤、转移模型，进一步在体内证实miR-375对药物敏感性及转移的影响；9、通过报告基因实验、QRT-PCR、Westernblot和MTT等方法对miR-375的靶基因IGF1R进行功能验证，以初步探讨miR-375参与HER2阳性乳腺癌耐药的可能分子机制。【结果】1、 Herceptin耐药细胞株恶性程度较高且miR-375表达量降低我们通过对HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3进行6个月左右的Herceptin药物压力筛选，获得了稳定的Herceptin耐药细胞株。耐药细胞模型建立成功，可作为后续实验的模型。软琼脂克隆形成实验证实，与亲本细胞不能在软琼脂中形成克隆相比，耐药细胞显示了显著的克隆形成能力；同时侵袭实验表明，耐药细胞的侵袭能力也显著高于亲本细胞。这些结果提示，耐药细胞恶性程度高于亲本细胞。通过microarray筛选和QRT-PCR检测，发现miR-375为下调最为明显的miRNA之一（0.09%-0.13%），具有统计学意义（p<0.05）。2、miR-375在HER2阳性乳腺癌耐药中的作用我们构建了miR-375前体的慢病毒表达载体(plenti6/v5-pre-miR-375)及对照载体，购买商品化的miR-375inhibitor及对照，感染或转染耐药及亲本细胞后经MTT、AnnexinV/PI染色法、软琼脂克隆形成以及动物体内等实验进行研究。结果均提示，miR-375过表达的耐药细胞株（SK-BR-3R）药物敏感性明显低于对照组。而miR-375下调的亲本细胞（SK-BR-3P）耐药性要高于对照组，说明miR-375调控了HER2阳性乳腺癌细胞的耐药。3、miR-375在HER2阳性乳腺癌耐药细胞转移中的作用我们通过前期包装的慢病毒对HER2阳性乳腺癌耐药细胞进行miR-375的上调，购买商品化的miR-375inhibitor及对照，转染耐药及亲本细胞后，通过体外划痕、侵袭以及体内动物肿瘤转移模型建立等实验多方面、多角度的验证了miR-375对肿瘤细胞侵袭、转移的影响。我们发现，通过转染慢病毒而上调了miR-375的水平后，与对照相比，HER2阳性乳腺癌耐药细胞的迁移、侵袭能力发生了明显的下降。提示miR-375在HER2阳性乳腺癌耐药细胞转移中发挥重要的作用。4. miR-375可能通过IGF1R参与HER2阳性乳腺癌耐药与转移miR-375可以抑制IGF1R的表达，并且报告基因实验证实，miR-375可以与IGF1R的3’UTR结合并抑制荧光素酶报告基因表达。shRNA阻断IGF1R的表达后，可以增强miR-375呈低表达的乳腺癌耐药细胞对Herceptin药物的敏感性，部分逆转乳腺癌耐药细胞的耐药及转移表型。而且，western blot实验证实，miR-375通过抑制IGF1R的表达进而影响PI3K/AKT通路的活化来调控乳腺癌耐药的。因此，miR-375可能通过调节IGF1R而参与乳腺癌耐药及转移。【结论】本研究建立了Herceptin耐药的HER2阳性乳腺癌细胞系，首次发现miR-375在乳腺癌耐药细胞中表达量明显降低。上调miR-375的表达可增加乳腺癌细胞对药物的敏感性，抑制耐药细胞的转移，并逆转耐药表型，而下调miR-375可以增加耐药性且促进迁移。另外，miR-375可能通过调节IGF1R而参与乳腺癌耐药。这一研究将为乳腺癌耐药治疗提供新的思路和靶点。