论文部分内容阅读
轮状病毒(Rotavirus,RV)为呼肠孤病毒科的成员之一,由11段dsRNA组成的基因组,形成非完全封闭的二十面体结构,轮状病毒的基因组分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)。病毒外壳是由3个同心圆蛋白层组成,内层由VP1、VP2和VP3构成,中间层由VP6构成,外层由VP4和VP7构成,VP4和VP7都含有病毒的中和抗原,但比较发现VP7的抗体能更好的发挥作用。轮状病毒能引起人和动物腹泻,是婴幼儿腹泻的主要病原。世界各国每年约有100万儿童死于RV所致腹泻,严重威胁着婴幼儿的健康。经过十几年的研制,目前多种RV疫苗研制工作也取得一定的进展,但多携带有部分副作用,尚无完美有效的治疗药物,所以开发更安全、更有效、更廉价的轮状病毒疫苗是今后发展的方向。
首先设计轮状病毒结构基因VP2,VP6和VP7的携带有6×His标签的原核表达引物,利用PCR扩增各目的基因,分别将目的基因片段连接到载体pET32a,(+),转化大肠杆菌,获取阳性表达克隆pET32a-VP2,pET32a-VP6和pET32a-VP7,IPTG诱导收集表达的各目的蛋白,以Ni-NTA层析柱纯化表达的蛋白,并用SDS-PAGE、western blot和Elisa等方法分析鉴定。纯化得到的各目的蛋白,分3次免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采血进行抗体活性的检测,制备得到活性良好的多克隆抗体,-20℃保存备用。
本实验是利用改良的BmMultiBac表达系统介导轮状病毒结构蛋白VP2,VP6和VP7构成的轮状病毒样颗粒在昆虫细胞(BmN)和家蚕幼虫体内的表达。BmMultiBac表达系统由2个供体载体pFBDM和pUCDM和改造过的受体Bacmid组成。其中pFBDM载体来源于pFastdual,含有Tn7转座序列和Gm抗性基因、双启动子(p10和多角体polh启动子)、2个MCS、2个polyA加尾信号序列(SV40,HSVtk),pUCDM含R6k7条件型复制子和Cm抗性基因,还有一个Loxp位点,受体Bacmid保留了原有的Tn7转座受体位点,又引入了1个Loxp位点。转移载体pFBDM携带外源基因通过Tn7转座进MultiBacmid,转移载体pUCDM携带外源基因经Cre-Loxp位点特异性重组进MultiBacmid,可同时实现轮状病毒结构蛋白多个基因的表达。
构建的转移载体pFBDM-VP6/7/zg,pUCDM-VP2和pUCDM-VP6/7/zg,分别通过Tn7和Cre-LoxP重组将外源基因整合至BmMultiBac中,得到重组的BmMultiBac-VP2/6/7/zg,BmMultiBac-VP6/7/zg,BmMultiBac——VP6/7/6/7/zg,带绿色荧光标签的重组BmMultiBacmid,转染BmN细胞,收集病毒液按一定剂量注射五龄第1d的家蚕,荧光检测感染重组病毒5d后的家蚕,收集家蚕血淋巴细胞,用SDS-PAGE电泳,western blot的方法检测到各目的基因在BmN细胞和家蚕体内都得到表达,然后氯化铯密度梯度离心和双水相系统2种方法对感染重组病毒的BmN细胞和家蚕血淋巴中表达轮状病毒样颗粒进行纯化。制备BmN细胞切片和纯化后病毒的负染切片,通过扫描电镜观察发现,VLPs在BmN细胞内和家蚕幼虫体内都得到很好的组装和表达。