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近年来,虽然辅助生殖技术得到了快速发展,但仍有5%～11%的患者在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）治疗中出现反复种植失败（recurrent implantation failure,RIF）,关注这部分患者是提高试管婴儿成功率的关键。RIF的病因复杂,可能涉及配子或胚胎质量及其发育潜能、宫腔环境、免疫因素和血栓前状态等方面,但目前RIF的病因和发病机制尚不完全清楚。随着高通量测序技术的进步,越来越多研究表明,生物过程的调节不仅依赖于信使RNA（messenger RNA,mRNA）,还依赖于非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,如长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）,微小RNA（micro RNA,mi RNA）和环状RNA（circular RNA,circ RNA）。lnc RNA可充当mi RNA的“分子海绵”,通过竞争性结合mi RNA,从而调节mi RNA靶向m RNA的表达,形成竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调节网络,ceRNA网络已被证明与癌症和多囊卵巢综合征等多种疾病的发生发展有关。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）是用于描述不同样本之间的基因关联模式的一种生物信息学分析方法,可鉴定出候补生物标记基因或治疗靶点。目前,与RIF发生相关的mi RNA-lnc RNA-m RNA协同调控网络以及起关键作用的枢纽基因尚不清楚。ceRNA理论和WGCNA分析方法为探究RIF的发病原因和机制提供了新的思路。本研究从高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中获得了RIF相关的m RNA,mi RNA和lnc RNA的表达谱,通过生物信息学分析建立ceRNA调控网络,并鉴定出与RIF相关的枢纽基因,进一步在正常对照组和RIF组患者黄体期子宫内膜中进行验证,初步探究了mi RNA-lnc RNA-m RNA协同调控网络和枢纽基因在RIF发病中的潜在作用。目的:1.对GEO数据库中RIF相关的lncRNA、miRNA和mRNA数据集表达谱进行差异分析,并构建RIF相关的ceRNA调控网络。2.通过WGCNA分析RIF相关的枢纽基因,并鉴定出ceRNA网络中的RIF相关关键基因。3.在正常对照组和RIF组患者黄体期子宫内膜中验证枢纽基因的表达情况,对关键基因进行分子调控机制和功能预测,为RIF的病因学研究提供思路和依据。方法:1.差异分析:从GEO数据库分别下载RIF相关的lncRNA、miRNA和mRNA表达谱数据集:GSE111974、GSE71331和GSE71332。利用RStudio软件的“limma包”和在线分析工具“GEO2R”进行差异分析,差异分析的结果通过R包“ggplot2”绘制热图及火山图。2.构建ceRNA调控网络:通过“Target Scan”和“miRTar Base”数据库预测差异表达的mi RNAs（differentially expressed miRNAs,DEmiRNAs）可能结合的mRNA,并与差异表达的m RNAs（differentially expressed m RNAs,DEm RNAs）取交集后用来构建mi RNA-m RNA相互作用对,利用“Starbase”和“Lnc Base V2”数据库预测DEmi RNAs可能结合的lnc RNA,并与差异表达的lnc RNAs（differentially expressed lnc RNAs,DElnc RNAs）取交集后用来构建mi RNA-lnc RNA相互作用对。通过整合mi RNA-m RNA和mi RNA-lnc RNA相互作用对,构建lnc RNA-mi RNA-m RNA三联ceRNA调控网络;使用“Metascape”对ceRNA网络中的DEm RNAs进行基因本论（Gene Ontology,GO）功能注释分析和通路富集分析。3.WGCNA分析和枢纽基因鉴定:使用加权基因相关网络分析识别共同表达的基因模块,探索基因模块与表型之间的关系,以及研究网络中的枢纽基因。4.关键基因调控网络预测:将ceRNA网络中的DEmRNAs与WGCNA鉴定出的枢纽基因取交集,得到RIF相关ceRNA调控网络中的关键基因。利用“STRING”数据库对RIF相关的关键基因构建蛋白质-蛋白质互作网络;获取“ENCODE”数据库中染色质免疫共沉淀数据对RIF相关的关键基因构建mi RNA-关键基因和转录因子-关键基因网络。5.免疫浸润分析:通过Spearman相关性分析确定RIF相关的关键基因与免疫浸润细胞的相关性。6.实验验证:使用Real-time qPCR技术检测正常对照组和RIF组患者黄体期子宫内膜中枢纽基因的mRNA表达情况;用Western-Blot技术和免疫组化技术检测关键基因蛋白表达和定位。结果1.差异分析:在mRNA数据集GSE111974中得到了442个DEmRNAs,其中包括245个上调基因和197个下调基因。lncRNA数据集GSE71331中得到了1270个DElncRNAs,其中包括1005个上调基因和265个下调基因。mi RNA数据集GSE71332中得到了50个DEmi RNAs,其中包括43个上调基因和7个下调基因。2.ceRNA调控网络:构建了一个由31个miRNA,88个mRNA和32个lncRNA组成的RIF相关ceRNA调控网络。3.WGCNA分析和枢纽基因鉴定:WGCNA分析鉴定出RIF相关的7个枢纽基因:白细胞介素2（interleukin 2,IL2）,白细胞介素2受体Alpha（interleukin 2receptor subunit alpha,IL2RA）,白细胞介素2受体Beta（interleukin 2 receptor subunit beta,IL2RB）,CC趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2,CCR2）,CC趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）,血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM1）,杀伤细胞凝集素样受体K1（killer cell lectin like receptor K1,KLRK1）。在数据集表达矩阵中,与对照组相比,枢纽基因中的VCAM1、KLRK1、CCR2、IL2和IL2RA的m RNA表达在RIF组降低（P＜0.05）,IL2RB和CCL2的m RNA表达在两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。4.关键基因调控网络预测:将ceRNA网络中的88个DEmRNAs与WGCNA分析中的7个枢纽基因取交集得到2个RIF相关ceRNA网络中的关键基因:VCAM1和IL2RA。ceRNA网络中的关键基因（VCAM1和IL2RA）的蛋白质-蛋白质互作网络中共有7个蛋白质,形成14个蛋白质-蛋白质相互作用对,其中VCAM1与IL2RA并没有直接的相互作用关系。转录因子-关键基因网络共包含17个节点,18个相互作用关系对。mi RNA-关键基因网络共包含20个节点和19条边。其中VCAM1基因受到17个mi RNA的调控,IL2RA受到2个mi RNA调控。5.免疫浸润分析:VCAM1和IL2RA与多种免疫细胞之间存在明显的正相关性。VCAM1基因与Activated.CD8.T.cell和Type1.T.helper.cell等免疫细胞存在显著正相关;IL2RA基因和Regulatory.T.cell与Central.memory.CD8.T.cell等免疫细胞之间存在显著正相关。6.实验验证:收集Control组和RIF组患者黄体期子宫内膜对枢纽基因进行实验验证,RT-q PCR结果显示,与正常对照组相比,RIF患者黄体期子宫内膜中VCAM1、KLRK1、CCL2和CCR2 m RNA表达均显著降低（P＜0.01）,IL2、IL2RA和IL2RB的m RNA表达在两组间无统计学差异（P＞0.05）,Western Blot结果显示RIF患者黄体期子宫内膜中VCAM1蛋白表达降低（P＜0.05）,免疫组化结果显示VCAM1主要定位于子宫内膜蜕膜细胞的胞质中。结论1.本研究筛选出RIF相关差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA并构建RIF相关的ceRNA调控网络,通过WGCNA分析鉴定出RIF的7个枢纽基因（VCAM1、KLRK1、CCL2、CCR2、IL2、IL2RA和IL2RB）。2.VCAM1在RIF相关ceRNA调控网络中发挥关键作用,在RIF患者中表达下降,并与免疫浸润相关。推测VCAM1可能通过免疫调节影响胚胎种植过程,但需要进一步实验验证。