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肺表面活性物质(PS)是一种主要由磷脂和特异性蛋白质组成的脂蛋白复合物。PS的缺乏可引起呼吸窘迫综合征,特别在早产儿,发病率和死亡率都很高。外源性肺表面活性物质(PS)的替代治疗已被证实是呼吸窘迫综合征最有效的治疗手段,在其它肺部疾病的治疗中也具有潜在的应用价值。但目前,PS制剂的制备方法繁琐,产量、纯度低,成本高,有机溶剂污染严重,限制了它在临床上的广泛应用。因此,建立一种简便、高效、安全的提纯制备PS的方法具有重要实用价值。 超临界流体萃取技术(SFE)是以超临界流体作为萃取剂的一种新型分离技术,具有快速、自动化操作、影响因素易于控制、不使用或少使用有机溶剂等优点。以CO2为超临界流体,特别适合于热敏性、脂溶性、高沸点等化合物的分离提取。磷脂遇热不稳定,易氧化,用超临界CO2技术提纯,可避免磷脂在提取过程中的氧化分解。 本研究根据超临界CO2可溶解PPS粗品中的中性脂质等低极性成分,成功运用SFE-CO2技术提纯猪肺表面活性物质,得到磷脂含量较高的PS产品。为了尽可能地增大超临界流体与被萃取物的接触面积,提高流体溶剂的渗透性,从而提高其对低极性成分的溶解度,提高萃取效率,本研究在萃取开始前需先将PPS粗品与一定比例的硅藻土充分混匀。该法以猪肺支气管肺泡灌洗液为原料,首先将经低温高速离心获得的PPS粗品与一定量的硅藻土用少量乙醇、乙醚溶剂混匀分散,挥发溶剂后将该混合物放入萃取槽进行超临界萃取,以去除其中的低极性成分,最后取出萃取槽中残余物,用抽吸过滤的方法分离硅藻土。 本实验通过单因素对比实验以及正交设计,分析影响萃取效率的因素,得出萃取PPS中的中性脂质等低极性成分的最佳条件为样品与硅藻土1:1.5混合,萃取压力30Mpa,萃取温度50℃,以无水乙醇为夹带剂,剂量为1gPPS粗品0.2ml,先静态萃取20分钟,再动态萃取4小时。从正交实验结果可以看出,萃取效率随着压力和动态萃取时间的增加而增加,这两个因素的变化对萃取率有显著影响,而萃取温度和夹带剂剂量对革取效率的影响无显著意义。 本法所得产物中总磷脂含量达91.33土1.58地 甘油M酯占0.72士0.11%,胆固醇占 0.66士0.10%,蛋白质占 2.36土0.sl*。经薄层层析(TLC)分析得知PPS产物中包含六种磷脂成分,经高效液相色谱(HPLC)定量分析,其中最主要的活性物质一磷脂酚胆碱(PC)含量达SI.42士2.35%。 用膜天平对所得产物的生物学活性进行测定,其可将最小表面张力降到10inN加以下,说明该提纯过程不影响PS的表面活性功能。