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背景高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papillomaviruses, HR-HPVs)(如HPV16等)病毒癌基因E6的持续表达是宫颈癌最重要的致病因素。本课题组设计并筛选了靶向HPV16E6且沉默效应均达95%以上的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA),经Agilent人基因组表达谱芯片分析,发现沉默E6表达后,粘蛋白抗原16(mucin antigen16, MUC16)基因表达下调(2-5倍)。MUC16是否是HPV16E6的直接作用靶点及调控机制尚不清楚。因此,深入研究E6与MUC16的关系,对探索HPV16相关肿瘤新的治疗方法具有重要意义。目的以HPV16E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系、正常宫颈鳞状上皮、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)和宫颈鳞癌组织为研究对象,从细胞和组织水平分析HPV16E6和MUC16的关系,试图阐明MUC16在HPV16相关宫颈癌发生与演进中的作用,丰富HPV16E6的致癌机制。方法1.以HPV16阳性(CaSku SiHa细胞)和阴性(C-33A细胞)的宫颈癌细胞为研究对象,采用Western blotting方法检测HPV16E6和MUC16的表达,并分析二者的关系。2.以HPV16E6阳性和阴性的正常宫颈鳞状上皮、CIN和宫颈鳞癌组织为研究对象,采用免疫组化方法检测HPV16E6和MUC16的表达,并分析二者的关系。3.利用生物信息学技术设计靶向MUC16mRNA的shRNA序列,采用分子克隆方法构建含靶向MUC16的shRNA的pGenesil-1真核表达重组质粒(命名为pGenesil-l-shRNA-MUC16)和含无关序列的对照质粒(命名为pGenesil-1-shRNA-vect)。4.通过脂质体介导将上述质粒分别转染入HPV16E6阳性的宫颈癌CaSki细胞(分别命名为CaSki-shRNA-MUC16和CaSki-shRNA-vect细胞)。G418筛选抗性细胞。通过RT-PCR和Western blotting方法鉴定MUC16沉默效应。5.通过Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术、Caspase-3活性测定、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验,检测靶向沉默MUC16表达后HPV16E6阳性宫颈癌CaSki细胞凋亡和迁移侵袭能力的变化。结果1. Western blotting结果显示：①C-33A细胞中HPV16E6无表达,CaSki细胞和SiHa细胞中可见HPV16E6表达；②C-33A细胞中MUC16的表达显著低于CaSki细胞和SiHa细胞(P<0.01),CaSki细胞和SiHa细胞中的MUC16的表达差异无显著性(P>0.05)。2.免疫组化结果显示：(DHPV16E6阳性的正常宫颈鳞状上皮、CIN和宫颈鳞癌组织中MUC16的表达均显著高于HPV16E6阴性的正常宫颈鳞状上皮、CIN和宫颈鳞癌组织(相关系数分别为0.531、0.629和0.452,P<0.01)。3.含MUC16shRNA真核表达重组质粒的鉴定结果显示：目的片段插入位点和方向正确,与设计一致。4.靶向MUC16mRNA的shRNA对宫颈癌CaSki细胞中MUC16表达的沉默效应RT-PCR结果显示：与CaSki细胞和CaSki-shRNA-vect细胞相比,CaSki-shRNA-MUC16细胞中MUC16mRNA的表达显著降低(P<0.01),沉默效率为：93.137%。而CaSki细胞和CaSki-shRNA-vect细胞中MUC16mRNA的表达差异无显著性(P>0.05)。Western blotting结果显示：与CaSki细胞和CaSki-shRNA-vect细胞相比,CaSki-shRNA-MUC16细胞中MUC16蛋白的表达显著降低(P<0.01),沉默效率为：93.913%。而CaSki细胞和CaSki-shRNA-vect细胞中MUC16蛋白的表达差异无显著性(P>0.05)。鉴于以上研究结果,后续实验中均以CaSki-shRNA-MUC16细胞为实验组,以CaSki-shRNA-vect细胞为对照组。5.靶向沉默MUC16表达对HPV16E6阳性宫颈癌CaSki细胞凋亡和侵袭的影响：①Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：CaSki-shRNA-MUC16细胞凋亡均数明显高于CaSki-shRNA-vect细胞(P<0.01),凋亡细胞百分比分别为：5.598%和0.150%；②Caspase-3活性测定结果显示：与CaSki-shRNA-vect细胞相比,CaSki-shRNA-MUC16细胞中Caspase-3活性显著增加(P<0.01)；③Transwell迁移和侵袭实验的结果均显示：与CaSki-shRNA-vect细胞相比,CaSki-shRNA-MUC16细胞穿过小室底膜的细胞数均显著减少(P<0.01)。结论1.在HPV16E6阳性和阴性宫颈癌细胞系和宫颈组织中MUC16与E6表达呈正相关。2.靶向沉默MUC16的表达可促进HPV16E6阳性宫颈癌CaSki细胞的凋亡,并抑制其迁移侵袭能力。