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目的:人类线粒体DNA是一条全长为16 kbp的双链闭环分子,含有37个基因,其中2个为rRNA基因,还有22个tRNA基因。与核基因组相比,因其缺乏组蛋白保护和必要的损伤修复系统,又直接暴露于线粒体高氧环境中,易产生氧自由基等物质,本身又不能合成谷胱甘肽将这些过氧化物有效地清除,因此线粒体DNA突变在退行性疾病及肿瘤疾病广泛存在。在包括病毒性肝炎所致肝癌在内的多种肿瘤中,大多数突变和多态性集中于线粒体DNA非编码区( D - loop区),此区含有线粒体DNA的重链和轻链复制起始点,是控制mtDNA复制和转录的重要区域,在遗传上是高变区。在酒精相关性肝癌,由于酒精滥用使肝细胞中氧自由基增加,可引起的线粒体DNA损伤及D - loop区突变,但D-loop区突变与酒精性肝癌的关系,目前研究甚少。肝细胞病毒除了引起氧化应激之外,还可能整合进入细胞的染色体DNA当中以发挥进一步的致癌作用,因此在酒精相关性肝癌及病毒相关性肝癌中,可能存在致癌机制的差别。本研究拟通过对酒精及病毒相关性肝癌的癌组织、癌旁组织、术前外周血组织及正常肝组织的线粒体DNA的D-loop区测序、对比、分析,了解其在D-loop区的多态性及突变的不同情况,并进一步阐明其在肿瘤形成和发展中的作用机制,以期为肝癌的发病机制提供可靠的理论依据。方法:1研究对象:49例乙肝病毒相关性肝细胞肝癌(以下称乙肝组)及11例酒精相关性(酒精摄入量>40g/d,持续5年以上)肝细胞肝癌(以下称酒精组)的癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘2cm以上,由病理切片确诊)、术前外周静脉血组织;38例肝血管瘤的正常肝组织作为对照,所有肝癌患者均为河北医科大学第四医院肝胆外科2007年9月~2008年7月住院病人,行肝癌根治手术。患者术前未进行任何临床治疗。病理类型均经河北医科大学第四医院病理科两名主任医师确诊。2 mtDNA提取:首先利用差速离心方法,去除细胞核,得到纯化的线粒体组织,以避免核DNA的干扰(通过对人线粒体DNA全序列和人类核基因组全序列的比较发现,mtDNA的大部分序列在核基因组上都有同源序列,这说明对mtDNA的分析要尽可能地排除核DNA的污染)。肝组织及血组织的mtDNA分别用相应试剂盒提取,提取后至于-20℃保存备用。3 PCR扩增线粒体DNA的D-loop区,上游引物为5’-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3’,下游引物为5’-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3’,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实后,送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。4我们选择49例乙肝相关性肝癌及11酒精相关性肝癌,术前空腹抽取外周静脉血,测定其AFP及肝功能(ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、TP、Album)AFP采用电化学发光免疫分析(ECL),原理为在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,包括了电化学和化学发光二个过程。ALT、AST、GGT采用测定酶活力的速率法,原理是根据酶所催化反应的速率来测定酶活力的大小,TB、DB、TP、Album采用终点法。5使用student’s T检验、x2检验和Wilcoxon秩和检验来分析两组之间年龄,性别等临床资料的差别,并探讨D-loop区域多态性及变异与临床资料的关联性。结果:1乙肝组与酒精组临床资料对比:年龄、TP、ALB、TBIL、DBIL、GGT在两组之间无显著性差异。ALT(Z=-2.341,P=0.019)、AST(Z=-3.097,P=0.002)、AFP平均值(Z=-3.582,P=0.000)、AFP升高比例(χ2=20.093,P=0.000)在两组之间有显著性差异。乙肝组肝功能损害较重,AFP升高明显。2在60例患者全长均为982bp测序序列中,与剑桥序列相比,发现91个多态性位点(血组织、癌旁组织、癌组织三者一致,但与剑桥序列不符,称之为多态性),多态率为9.27%。3在152位点,乙肝组49例患者有18例含有碱基C,酒精组11例患者无一例含有C,P=0.012;在249位点,乙肝组49例患者有15例未含有A,酒精组11例患者均含有A,P=0.030;在16293位点,酒精组11例患者有2例含有G,正常组均无G,P=0.047。4在全长982bp的测序序列中,在11个位点上有26位患者发现了29次DNA变异,突变率为43.3%(26/60);其中10个位点为碱基错配的点突变,另一位点突变次数高达18次(18/60),变异形式包括单个碱基的缺失及插入,其中有一例为大片段缺失。在正常肝血管瘤对照组中,未发现任何一例有以上位点的变异。我们将继续对患者进行随访,以期发现突变及多态位点与肝癌预后的关系。结论:1 AFP升高例数、ALT值、AST值在乙肝组及酒精组中存在显著差异,在乙肝组中ALT值及AST值明显高于酒精组,即乙肝组的肝功能损害较重。AFP在酒精性肝癌组中多无升高,因此需寻找新的敏感性高的临床标记物。2在152、249位点,酒精组与乙肝组及对照组存在显著差异,在16293位点,酒精组与正常组存在显著差异,及AFP升高比率在乙肝组及酒精组存在显著性差异,均提示两组的癌变机制可能存在某些差别。3线粒体DNA D-loop区是一个高度多态及高突变区域,突变以碱基替换为主,均为同质性突变,在两组中分布频率无差别;在肝血管瘤中未发现相应位点变异,提示D-loop区的突变可能与细胞癌变或癌的易感性有关。