冷等离子体技术作为一种新型高效环保可持续发展的食品加工方法,已成熟地应用于食品、生物材料以及加工过程中的微生物净化。近来,冷等离子体的应用领域拓展到研究冷等离子体处理对食品体系中蛋白质分子及其相应的技术功能或理化性质以及致敏性的影响,冷等离子体气体中的活性物质均会引起蛋白质构象和结构的改变。在冷等离子体与蛋白相互作用的过程中,加工参数如处理时间、电压、功率、气源种类、处理环境以及样品属性均会影响处理后蛋白质在食物系统和人体中的特性功能。而包含大量氨基酸/蛋白质的重要食品的典型示例是甲壳类动物,例如凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),这些氨基酸/蛋白质在食品系统中既表现出技术功能特性,又能够引起人体内的过敏反应。因此,必须详细了解等离子体处理与凡纳滨对虾各种肌肉蛋白的相互作用原理。鉴于此,本课题以含有丰富的氨基酸/蛋白质的甲壳类水产品凡纳滨对虾蛋白质为研究对象,以DBD和RF两种放电类型的冷等离子体介导的氧化微环境为切入点,结合分子生物学、光谱学及免疫学等分析技术,从蛋白质结构、血清学分析、体外模拟消化实验等几个层面,探索冷等离子体处理对凡纳滨对虾蛋白结构及功能特性的影响以及对原肌球蛋白致敏性的影响,进一步揭示冷等离子体新型物理场调控蛋白质过敏原的作用机制,进而阐明冷等离子体消减水产品致敏性的分子机制,为开发新型食物过敏原脱敏技术提供理论基础,为研制无致敏性和低致敏性的虾制品提供科学依据。具体研究内容如下:1.冷等离子体处理对凡纳滨对虾的肌纤维蛋白的影响。通过提取和纯化虾肉中的肌纤维蛋白,采用大气压冷等离子体射流(APPJ)装置(以空气作为气源),研究冷等离子体处理时间(0、2、4、6、8和10 min)对肌纤维蛋白的影响。OES光谱结果显示,在空气等离子体中观察到的活性成分包括活性氮(RNS)和活性氧(ROS,如N2,(UVA),N2+,(UV-B),NO,OH自由基和原子氧,而硝酸(HNO3)和亚硝酸(HNO2)的产生分别被认为是在液体介质中发生酸化和氧化作用。实验结果表明,冷等离子体处理过程中形成的ROS和RNS导致p H值下降。样品经APPJ处理后,蛋白质的二级结构和三级结构均发生了改变,导致蛋白质溶解度降低,粒径增大,浊度增大,发泡能力增强。这些结果证实了以空气为气源产生的冷等离子体含有大量氧化和反应性物质,这些氧化和反应性物质能够导致MPs的展开,并且在较长的时间内,可以导致对虾蛋白质二级结构蛋白几乎完全降解。2.冷等离子体处理对凡纳滨对虾的肌动球蛋白(NAM)的影响。本研究采用APPJ系统(以98%Ar+2%O2为气源)用于处理对凡纳滨对虾中的NAM,处理时间为0、1、2、3、4、5 min。但由于采用了不同的气体组成,OES发射光谱显示,主要由不同激发态氩的发射谱线和强原子氧的存在组成。实验结果表明,与对照组相比,5 min后NAM的乳化活性指数和发泡性能均有显著提高(P<0.05)。同时NAM的溶解度没有显著变化,因为除了处理时间5min外,处理时间从1到4 min,蛋白在350 nm的吸光度(表征浊度)随冷等离子体处理时间增加而逐渐增加,而这是由于蛋白质单体的聚合或聚集造成的。这些变化是蛋白质相互作用的结果,蛋白质相互作用促使蛋白质分子的二级和三级结构发生变化,从而影响蛋白质在食品系统中的功能。3.评估APPJ对原肌球蛋白(TM)的分子结构和致敏反应的影响。TM是甲壳类动物中发现的主要致敏蛋白。实验结果表明,对于TM的Ig E反应性,约17.6%的Ig E结合能力显著降低,而对于Ig G结合,约26.87%的降低是由于构象表位的断裂造成的。应用APPJ处理3~9 min后,TM抗原性仅有轻微变化。用APPJ处理更长时间下,TM表面疏水性和总巯基大幅度变化,伴随着二级结构比例的明显变化(分别包括α-螺旋的减少和β-折叠的增加。这些三级和二级结构的修饰变化可能共同影响TM的抗体结合能力。Ig G和Ig E结合能力的降低可能是由于TM构象结构的改变和疏水或亲水性残基的释放,这会导致抗原表位重新定位。4.研究超声波联合介质阻挡放电(DBD)产生的冷等离子体对TM的致敏性、消化率和构象完整性的影响。实验结果表明,在凡纳滨对虾TM超声处理(4-20 min)前5 min进行冷等离子体预处理,经蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析,对凡纳滨对虾TM的致敏性有较大程度的降低。在冷等离子体联合超声处理(PU)中,Ig E识别电位降低了79%,而单独用冷等离子体和超声波处理时,Ig E识别电位最高分别降低了47%和23%。此外,这种联合方法显著提高了TM的消化率。PU处理影响蛋白质的二级结构比例、总巯基含量和疏水性,表现为蛋白的展开。准确地说,TM的结构较为松散,允许氨基酸残基氧化和肽键的裂解,从而导致抗体结合位点的失向或破坏。综上所述,需要重点考虑的是,在生产冷等离子体技术加工的海鲜新产品时,在实际食品体系或人体消化吸收方面,冷等离子体诱导的和虾肉蛋白的相互作用对其功能特性和致敏性的潜在影响。本次研究中,应用了冷等离子体在对虾肌肉蛋白上的靶向性修饰,首次为冷等离子体技术用于增强蛋白的某些功能性质提供科学依据,从而促进蛋白质成分的资源化生产,用于改进现有产品以及开发新产品。此外,基于原肌球蛋白是虾体内主要的致敏蛋白,我们还发现冷等离子体处理是降低原肌球蛋白Ig G/Ig E结合能力的一种潜在有效方法,从而为生产低致敏性的虾肉产品提供了可能。这一发现对那些接触或摄入凡纳滨对虾后产生异常免疫反应的个体可能是有益的。此外,通过适当的分析技术,采用自上而下的方法对冷等离子体诱导效应进行了详细的研究,从宏观到分子水平展望了冷等离子体对蛋白的潜在作用机制。因此,冷等离子体处理作为蛋白质修饰的一种有效手段。本研究结果显示的积极结果表明,将冷等离子体技术纳入已有的海产品生产线操作单元中,是很有现实意义的。