近年来胎盘干扰素(interferontau，IFN-τ)作为新发现的一种Ⅰ型干扰素，越来越受到人们的重视。IFN-τ最初被称为滋养层蛋白-1(trophoblastprotein-1,TP-1)或滋养层素(trophoblastin)，是反刍动物在怀孕早期由滋养层细胞分泌的一类蛋白质，它是反刍动物母体妊娠识别孕体的信号，在黄体维持和妊娠建立过程中发挥重要的生物学功能。 IFN-τ属于Ⅰ型干扰素，具有Ⅰ型干扰素的许多共同特性，具有抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等多种生物学功能。但IFN-τ也有自身特点，与其他的干扰素不同，它仅在反刍动物怀孕早期由胚胎滋养层细胞在孕体植入前后的一段时间表达，无需病毒诱导；它显现出强的抗HIV等逆转录病毒活性；对多发性硬化的动物模型有明显的免疫抑制作用；它能够作用于多种细胞，具有跨种系的特点；可以减少反刍动物的胚胎和胎儿的流产率；此外，高浓度IFN-τ表现出较其他Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)所没有或较小的细胞毒性。基于其特有的抗病毒活性及低细胞毒性，为许多疾病的治疗带来新的希望。 随着IFN-τ在临床研究工作的不断深入，人们需要大量高纯度、有活性IFN-τ用于疾病的治疗研究。从反刍动物孕体内可以获得具有高度活性的IFN-τ，但是步骤繁琐、产量较低。目前，在国外已经有人通过大肠杆菌以融合蛋白的形式表达并纯化出重组IFN-τ，亦有人通过酵母菌、昆虫-杆状病毒等表达并纯化出重组IFN-τ。大肠杆菌可以高效表达IFN-τ成熟肽，由于IFN-τ以包涵体的形式表达，需要进行纯化和复性，这是本实验要解决的问题之一。 目前对IFN-τ抗黄体溶解以及信号转导、表达调控等机制已经进行了不同程度的研究；对抗逆转录病毒作用也作了大量的研究工作；该药作为一种有效的免疫调节剂治疗多发性硬化，自1999年在美国已经进入Ⅰ期临床阶段。另外，有文献报道IFN-τ可以抑制牛的MDBK细胞、鼠L929细胞以及人的WISH细胞的增殖，但尚无文献报道IFN-τ对肿瘤细胞的影响。本实验旨在应用纯化并经过复性的重组绵羊胎盘干扰素(roIFN-τ)检测其对急性粒单核细胞白血病细胞U937的影响。 研究目的： 本实验的主要目的是建立有效的纯化roIFN-τ的方法，以获得大量高纯度的roIFN-τ。另外，初步检测roIFN-τ在体外对U937细胞增殖的影响及其可能的机制。 研究方法： 1、roIFN-τ的表达与纯化 将重组质粒pBV220转化感受态大肠杆菌EcoliBL21，获得了高效表达外源蛋白roIFN-τ的工程菌。在30℃发酵培养，发酵过程中通过调节发酵罐的转速和通气量是培养基的容氧值保持在20％以上；利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCI调节pH值。以葡萄糖为碳源，酵母提取物和蛋白胨为氮源，补充养料。迅速升温至42℃诱导表达，roIFN-τ以包涵体的形式存在。利用超声裂解法破裂细菌，经多次反复洗涤后收集包涵体，用含8mol/L尿素的包涵体溶解液溶解目的蛋白，利用饱和硫酸铵溶液初步沉淀和纯化，再用尺寸排阻层析法纯化出较高纯度的roIFN-τ。 2、roIFN-τ的体外抑制肿瘤细胞增殖活性测定 取对数生长期的人类单核细胞白血病细胞株U937细胞加入不同浓度的roIFN-τ，应用噻唑蓝(MTT)还原法检测roIFN-τ对U937细胞的生长抑制率，应用流式细胞术(FCM)分析细胞周期、细胞凋亡以及fas、fasl和bcl-2凋亡相关蛋白表达情况。 研究结果： 1、发酵诱导4小时后的菌体用15％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，得到与预期蛋白分子量大小一致(21KD)的特异条带。包涵体溶解液经过硫酸铵初步沉淀，再经过凝胶过滤色谱层析纯化出高纯度的目的蛋白；纯化样品的SDS-PAGE电泳图谱经Totallab软件分析可知roIFN-τ的纯度达到98.52％。 2、根据MTT实验结果可以看出roIFN-τ对U937细胞增殖有明显抑制作用并呈剂量依赖性。0.445mg/ml、0.178mg/ml、0.089mg/ml和0.044mg/ml的roIFN-τ在作用48小时后的生长抑制率分别是60.97％、41.31％、20.82％和8.15％。FCM实验结果显示roIFN-τ可以促进细胞凋亡(p＜.05)；并且影响细胞周期，将细胞周期阻滞在S期(p＜0.05)；roIFN-τ上调fasl和bcl-2的表达(p＜0.05)，但对fas的表达没有明显的影响(p＞0.05)。 结论： 本实验建立了简单可行的可获得具有高纯度的roIFN-τ纯化方法。 体外实验显示roIFN-τ可以抑制U937细胞的增殖，诱导细胞凋亡。抑制细胞增殖的可能机制是roIFN-τ上调fasl的表达诱导细胞调亡并使细胞周期滞留在S期。