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本论文首先利用HisTrap~TM HP亲和层析和HiTrap DEAE FF离子交换层析对E coli BL21(DE3)-lipA/lip B抑菌株所产生的重组伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA进行了纯化;利用比色法测定了基本酶学性质;分析了重组脂肪酶LipA水解pNP脂肪酸酯系列底物及胆固醇酯系列底物的比活力;利用YASARA软件分别构建了脂肪酶LipA-三酰甘油酯及脂肪酶LipA-胆固醇酯对应的过渡态模型;叠加比较两种过渡态模型中各个氨基酸残基Ca原子的位置;将活性中心周围所有距离催化三联体的Ser羟基12A的氨基酸残基的Ca原子位置出现较大偏差的氨基酸残基作为潜在突变位点;对潜在突变位点的氨基酸残基进行丙氨酸扫描,并测定突变体的胆固醇酯酶酶活U/OD600,筛选出能显著影响其胆固醇酯酶酶活的关键氨基酸残基,为后续进一步构建饱和突变文库奠定基础。具体实验结果如下:1、经过纯化后得到电泳纯的重组伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA/LipB复合物;该复合物仅在极端苛刻条件(如强变性剂作用)下才可分开。测定重组脂肪酶LipA水解pNPL的比活力为547.02U/mg;纯化过程中酶活回收率为3.65%,纯化倍数为128.97倍。其催化水解反应的最适温度为40℃,最适pH8.0;40℃下的半衰期为31.98 min;Fe3+、Zn2+和Cu2+对脂肪酶酶活有显著的抑制作用;其催化三酰甘油酯水解水解时对位点sn-1和sn-3具有偏好性;对中等脂肪酸链长度的对硝基苯酯具有偏好性,其中对pNPD的水解活性最高,为638.86±10.28 U/mg;其水解其pNPD的Km和Vmax分别为 0.5691 mmol·L·和 2964μmol·mg1· minKcat 值为 1.96×105 min-1,Kcat/Km为3.44×105L·mmol-1·min-1。2、胆固醇酯的溶解性及其底物饱和底物浓度对重组脂肪酶LipA水解胆固醇酯的比活力具有显著影响;在分析比较的三种溶剂体系及四种胆固醇酯中,当以polyoxyethylene 10 tridecyl ether作为溶剂时,重组脂肪酶LipA对具有最大溶解度的胆固醇亚油酸酯的比活力最高,为5413.85±2.21mU/mg。3、叠加比较分析脂肪酶LipA-三酰甘油酯及脂肪酶LipA-胆固醇酯对应的过渡态模型,一共筛选出七个潜在的候选突变位点,分别为:Thr112,Phe119,Leu266,Val267,Leu287、Leu17和Leu167。利用定点突变技术,构建上述位点的丙氨酸置换突变体。通过显著性分析发现七个突变体的胆固醇酯酶酶活相比于野生型的均有显著性的差异,但突变体 LipA-L17A、LipA-F119A、LipA-L266A、LipA-V267A 和 LipA-L287A差异更大。上述突变位点的丙氨酸扫描结果表明:Leu17、Phe119、Leu266、Val267和LLeu287等五个氨基酸残基的侧链R基团对其胆固醇酯酶酶活有显著的影响。