【研究背景】据统计,世界范围内已确诊的糖尿病人数目已经超过1亿,糖尿病与心血管疾病的密切关系也受到更加广泛的关注:作为冠心病的等危症,糖尿病患者患冠心病的风险高于普通人2～4倍。越来越多的证据显示糖尿病性心血管病与心肌微血管的病理变化密切相关。在糖尿病早期就存在因血管收缩舒张功能异常和通透性功能障碍而导致的组织缺血;而心脏组织对此的常见代偿反应是产生某些诱导因子,促使新的侧枝循环建立,改善心肌的血液供应。但是,在糖尿病心血管并发症的研究中却发现糖尿病患者明显存在更严重的供血不足现象。由于早期糖尿病无任何临床症状,大部分研究都将注意力集中在病程的中后期(糖尿病动物模型建立后3～12个月);在方法上多通过心肌中血管内皮细胞的数目、功能等指标来间接反映血管的病理状态。但是,对于糖尿病早期阶段(糖尿病动物模型建立后1～2个月)心肌微血管病理变化的直接观察还未见报道。VEGF作为血管生成过程中最重要的因子,具有促进血管内皮细胞增殖、迁移和增生,增加血管通透性,以及影响血液动力学的作用。此外,它在糖尿病性心血管疾病发生发展中的重要作用也得到广泛的认可。但是在糖尿病中VEGF及其受体在心血管系统的表达情况至今仍未达成一致。PKC蛋白家族在糖尿病性心血管病中的重要作用已经成为大家关注的一个热点。在高血糖或糖尿病状态下,其亚型PKC–βⅡ的激活更被认为是至关重要的分子通路,会直接或间接导致细胞内信号通路的改变及血管功能的障碍,如微血管通透性增加。但是,关于PKC-βⅡ及其抑制剂LY333531在糖尿病心肌微血管通透功能中的研究并不多见。【研究目的】1.观察早期糖尿病大鼠心肌微血管的病理变化,并初步探讨VEGF及VEGFR2与其关系;2.初步观察PKCβⅡ在大鼠早期糖尿病性心肌中的表达,并在细胞水平对高糖所致心肌微血管内皮细胞通透功能障碍以及特异性PKC-β抑制剂LY333531的作用做进一步研究探讨。【实验方法】实验1:1.早期糖尿病大鼠模型的建立:雄性SD大鼠(6周龄)30只,高脂高糖饮食喂养8周后,一次性腹腔注射50mg/kg STZ,以多次随机血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病模型成功的标志,之后普通饲料喂养4周。并以年龄匹配的正常大鼠作为对照;2.右侧颈动脉逆行插管至左心室,记录血流动力学参数;3.通过血管铸型的方法,在扫描电镜下观察各组大鼠心肌微血管生成情况;4.以硝酸镧颗粒作为示踪剂,通过透射电镜观察各组大鼠心肌微血管通透性的变化;5.通过免疫荧光标记血管内皮细胞及TUNEL染色对各组大鼠心肌中血管内皮细胞的数量和凋亡情况做出比较;6.通过免疫组化/荧光和Western blot对各组大鼠心肌内VEGF及其受体VEGFR2的表达进行检测。实验2:1.动物模型建立同实验1;2.通过免疫荧光对各组大鼠心肌中PKCβⅡ的表达进行初步比较;3.通过组织分离和差速贴壁的方法培养心肌微血管内皮细胞并通过低密度乙酰脂蛋白进行鉴定;4.细胞实验分组:正常组,高糖组(葡萄糖浓度25mmol/L),高糖(葡萄糖浓度25mmol/L)+LY333531(10nmol/L)组,高糖(葡萄糖浓度25mmol/L)+生理盐水组;5.通过离体血管通透性检测试剂盒检测单层内皮细胞通透性;6.通过TUNEL荧光试剂盒检测各组心肌微血管内皮细胞的凋亡;7.通过免疫荧光和Western blot检测各组心肌微血管内皮细胞PKCβⅡ的表达。【实验结果】实验1:1.早期糖尿病大鼠造模成功率在80%以上,成功数为25只。与正常组相比,2.早期糖尿病大鼠出现明显心室舒张/收缩功能障碍;3.扫描电镜下可以观察到在早期糖尿病大鼠中出现多而杂乱的病理性心肌微血管生成;4.在透射电镜下,早期糖尿病大鼠心肌微血管通透性明显增加;5.免疫荧光结果显示早期糖尿病大鼠心肌中血管内皮细胞数目减少但凋亡率明显升高(P<0.01);6.免疫组化/荧光染色和Western blot结果均提示早期糖尿病大鼠心肌中VEGF表达上调而VEGFR2表达下调(P<0.01)。实验2:1.心肌组织的免疫荧光染色提示,与正常组相比,早期糖尿病大鼠心肌中PKCβⅡ的表达明显增加;离体细胞培养结果显示:2.通过组织分离及低密度乙酰脂蛋白染色阳性结果,确认实验所用为心肌微血管内皮细胞;3.与正常组比较,高糖组单层心肌微血管内皮细胞的通透性明显增强(P<0.01);而细胞凋亡率升高(P<0.01),同时,PKCβⅡ的表达上调(P<0.01);4. LY333531可明显降低PKCβⅡ的表达(P<0.01),缓解高糖对心肌微血管内皮细胞通透功能的破坏(P<0.01),并降低细胞凋亡率(P<0.01),而生理盐水对细胞通透性、凋亡率和PKCβⅡ表达的影响不显著。【结论】1.病理性血管发生和通透性增强是早期糖尿病大鼠心肌微血管病理变化的重要特征;2. VEGF和VEGFR2的不平衡表达可能加剧早期糖尿病大鼠心肌微血管的病变;3.高糖可以损害心肌微血管内皮细胞的通透功能,而PKCβⅡ与整个过程密切相关;4. PKCβ抑制剂LY333531可以有效拮抗高糖对心肌微血管内皮细胞通透性的损伤。