目的:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,非小细胞肺癌）的发病率占到所有肺癌的80%以上。目前非小细胞肺癌的治疗方法包括化疗、放疗和手术等。然而,非小细胞肺癌是一种具有侵袭、转移能力的肿瘤。侵袭性和转移性也是这类恶性肿瘤最显著的生物学特征。即使初次发现时已进行手术治疗并完全切除了肿瘤,术后也仍然需要给予辅助化疗等治疗手段以巩固疗效,而且其中仍然有部分患者会出现复发或者转移。因此,探讨非小细胞肺癌的侵袭、转移机制及其调控因素是非常有必要的。近年来发现,长链非编码RNA（long non-coding RNAs,Lnc RNAs）以RNA的形式在许多生物学过程（如表观遗传调控、转录和转录后调控）中发挥特定的功能。Lnc RNA具有调节基因表达的能力,并影响许多疾病过程,这其中就包括恶性肿瘤。有报道称许多Lnc RNA在非小细胞肺癌当中调控肿瘤生长。比如:在非小细胞肺癌中,Lnc RNA PTAR促进细胞增殖、迁移和侵袭,而Lnc RNA NBR2则抑制上皮细胞向间质转化（EMT）的进展。前期研究揭示了Lnc RNA TPTEP1（这里简称TPTEP1）在多种恶性肿瘤当中发挥抗癌作用,如肝细胞癌、胶质瘤等。在非小细胞肺癌细胞中,有报道称TPTEP1可以抑制细胞增殖。然而,TPTEP1在非小细胞肺癌肿瘤进展中的潜在机制尚不清楚。已经证实Lnc RNA可以作为竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNAs,ce RNAs）与micro RNA（miRNAs）位点结合,从而影响靶基因的表达。miRNA对疾病和肿瘤生物学的作用已经为人们所熟知。在我们的研究中,我们预测TPTEP1靶向作用于miR-761,miR-761已经被证明在各种恶性肿瘤中的致癌作用。例如,在三阴性乳腺癌中,miR-761诱导侵袭性表型,并增强滑膜肉瘤的耐药性。在非小细胞肺癌细胞中,miR-761也曾被报道促进肿瘤生长和转移。此外,我们还预测了miR-761与LATS2之间的相互作用。LATS2,是一种dbf2相关的激酶,是一种肿瘤抑制因子。研究表明,LATS2通过调节下游效应因子的功能来调控细胞发展走向。LATS2具有抑制肿瘤转移的作用,并同时受到miR-302、miR-372-3p等miRNA的调控。LATS2的抗肿瘤作用也已明确。LATS2的表达量降低提示NSCLC预后不良,LATS2可以促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长,抑制肿瘤细胞迁移及其活动性。在NSCLC中,虽然已经发现了TPTEP1、miR-761和LATS2各自的作用,但它们之间的相互作用还从未被研究过。在本实验中,我们研究了TPTEP1是否通过调控miR-761/LATS2轴来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,以期为NSCLC的治疗提供相关的理论依据。研究方法:1.细胞培养:实验中使用的细胞系均购买于上海细胞库,细胞培养环境为:含有10%检验合格的胎牛血清和100IU/ml双抗（青霉素-链霉素）的培养基中培养。肺癌A549,H1299细胞系使用的是RPMI1640培养基进行培养。所有细胞系及相关细胞学实验均在5%二氧化碳的培养箱,37°C环境中培养。2.定量实时聚合酶链反应（PCR）:根据先前的研究进行RNA提取（TRIzol试剂,Takara,日本,Otsu）、c DNA逆转（Revertaid c DNA合成工具包,Thermo Fisher Science）和扩增（ABI Prism 7900HT平台,应用生物系统,加利福尼亚州福斯特城,美国）。使用2-??CQ方法分别计算与U6和GAPDHm RNA表达相关的数据。3.MTT法:5000个细胞在100μL培养基中稀释,接种于96孔板中培养。每孔加入20μL 5 mg/m L四甲基偶氮唑盐溶液反应,静置培养3～4h,去除上清液后加入100μL二甲基亚砜。光密度（OD）值由微型平板阅读器（Bio Tek,Winooski,VT,USA）在570 nm处测定。4.细胞集落形成实验:取对数生长期的单层培养细胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的培养液中备用,将细胞悬液作梯度倍数稀释,计数细胞,并在含有培养基的6孔板中以500个细胞/孔的密度培养大约8-10天,经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的集落形成时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或【1:3的醋酸/甲醇】5m L,固定15分钟。然后弃去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。风干后根据计数菌落的数量进行量化分析。5.双荧光素酶报告基因:将5﹡PLB（Passive Lysis Buffer）用蒸馏水稀释至1﹡PLB,96孔板每孔加入100ml,用移液枪吹散细胞,室温下置于摇床15分钟,将细胞裂解液移至1.5ml离心管,4度12000 rpm离心10min,取上清移入新的管子;96孔板中加入LAR II（Luciferase Assay Reagent II）工作液100ml;加入20ml细胞裂解液,移液枪吹打混匀2-3次,测定记录Firefly luciferase值,此值为内参值。加入100 ml Stop&Glo?Reagent（Luciferase Assay Reagent,Progema）,移液枪吹打混匀2-3次,测定记录Renilla luciferase值,此即为报告基因发光值。6.Transwell（侵袭实验）:细胞侵袭实验是在24孔Transwell小室中进行的,小室孔径为8微米。实验组和对照组细胞在转染24小时后,用胰蛋白酶消化细胞并计数,24孔板下室加入600μl含有10%胎牛血清的培养基,注意不要产生气泡,影响趋化作用。上室中加入200μl含有2%胎牛血清的培养基。在transwell小室的上室中接种6×104个细胞,培养24小时后,用棉签擦去上室膜表面的细胞,用4%多聚甲醛固定,并用苏木素染色。在显微镜高倍视野下随机选择十个区域来计算侵袭细胞的数量。实验在同样条件下重复进行3次。7.划痕实验:在6孔板中加入6×105个细胞12h,然后用无菌吸管尖端在这些孔的表面做划痕,每孔用PBS冲洗以清除碎屑。在划痕形成后立即拍照,并在48小时后再次拍照。通过计算创面愈合面积百分比,得出细胞相对迁移率。8.统计分析:使用SPSS18.0软件进行统计分析,数据以至少三个独立实验的平均值±SD表示。组间差异分析采用t检验或单因素方差A,然后进行Bonferroni’s多重检验。经χ2检验,差异有统计学意义（P<0.05）。9.生物信息学分析:在实验初始阶段我们查询了GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）来分析肿瘤组织与正常组织的差异表达分析。GEPIA数据库是个在线分析工具,它可以分析来自TCGA和GTEx数据库的9736个肿瘤和8587个正常样品的RNA测序表达数据。研究成果:1.RT-q PCR检测TPTEP1在NSCLC肿瘤组织中的表达。与癌旁正常组织相比,32对非小细胞肺癌组织中TPTEP1的表达水平显著降低。通过生物信息学分析,预测了TPTEP1可以与miR-761结合。此外,miR-761与LATS2存在结合位点,因此我们进一步检测了miR-761和LATS2的转录表达水平。结果显示,与匹配的正常癌旁组织相比,miR-761在非小细胞肺癌组织中表达上调,而LATS2的表达则受到抑制。进而我们还分析了TPTEP1、miR-761和LATS2之间的相关性。发现miR-761与TPTEP1表达呈负相关,miR-761与LATS2表达呈负相关,TPTEP1与LATS2表达呈正相关。2.采用A549和H1299细胞（属于非小细胞肺癌细胞系）进行体外实验。通过TPTEP1pc DNA3.1转染细胞使TPTEP1过表达。TPTEP1过表达后细胞活力显著下降。集落形成实验也显示TPTEP1对细胞增殖有明显的抑制作用。继而我们分别进行划痕实验和Transwell来检测NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。结果表明,TPTEP1过表达抑制了NSCLC细胞的迁移能力和侵袭能力。这些结果提示TPTEP1具有抑制细胞增殖和侵袭的作用。3.我们采用Diana来预测TPTEP1和miR-761的结合位点。转染TPTEP1 pc DNA3.1后,TPTEP1的过表达显著降低了miR-761的表达量。为了探讨miR-761与TPTEP1之间的相互作用,我们采用了RIP法和双荧光素酶报告基因法两种实验方法来检测。miR-761模拟物提高miR-761的表达。相反的,miR-761抑制剂降低了miR-761的表达。无论在A549还是H1299细胞中,RIP实验都证实了TPTEP1和miR-761之间存在着相互作用。此外,miR-761显著抑制野生型TPTEP1转染细胞的荧光素酶活性,miR-761抑制剂则增强了其荧光素酶活性。而转染突变TPTEP1的细胞则无明显变化。因此,miR-761是TPTEP1的作用靶点。4.TPTEP1过表达显著抑制细胞活力,而miR-761模拟物可以阻断该抑制作用。这一结果也得到了集落形成实验的验证。miR-761与TPTEP1共同过表达后,miR-761显著阻断了TPTEP1对细胞增殖的抑制作用。此外,TPTEP1的过表达抑制了肿瘤的转移能力,而miR-761的过表达也对这一抑制作用起到了阻断的效果。由此可见,TPTEP1的抑制作用,包括抑制细胞增殖和侵袭的作用,是通过抑制miR-761来实现的。5.Starbase 2.0软件预测LATS2可能是miR-761的靶点。我们验证了TPTEP1的过表达增强了LATS2的表达。同时,在miR-761过表达的细胞中LATS2的表达下降,而在miR-761基因敲除的细胞中LATS2的表达显著增强。Western blot结果显示,LATS2在miR-761过表达的细胞中表达降低,而在miR-761敲低的细胞中表达显着增强。为了确定miR-761与LATS2之间的相互作用,我们进行了双荧光素酶报告基因实验,发现miR-761靶向作用于LATS2。这些结果表明LATS2是TPTEP1/miR-761的下游效应子,并被miR-761靶向作用。6.LATS2 shRNA显著降低LATS2的表达。我们转染miR-761抑制剂和LATS2sh RNA后,发现敲低miR-761可以抑制细胞活力,敲低LATS2可以增强细胞活力,而LATS2 sh RNA则逆转了miR-761抑制剂对细胞增殖效率的抑制作用。通过集落形成实验也证实了相类似的效应。LATS2 sh RNA可以阻断miR-761抑制剂对细胞增殖的抑制作用。我们发现miR-761抑制剂在抑制细胞的迁移和侵袭能力方面均存在作用。然而,LATS2基因被敲低后,细胞的迁移和侵袭能力均显著增强。因此说明,miR-761通过负性调节LATS2作用来对NSCLC肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。7.TPTEP1/miR-761/LATS2轴参与了EMT的调控。NSCLC细胞与TPTEP1pc DNA3.1、miR-761模拟物、miR-761抑制剂或LATS2 sh RNA共同孵育。然后我们检测了EMT相关蛋白N-cadherin、Twist、Vimentin、E-cadherin的表达。结果显示,TPTEP1过表达促进了E-cadherin的表达,而降低了N-cadherin、Twist和Vimentin的表达。过表达miR-761可以逆转TPTEP1的作用。进一步的,敲低miR-761基因增强了E-cadherin的表达,而降低了N-cadherin、Twist和Vimentin的表达。同样的,这些变化在敲低LATS2的情况下被逆转。结论:1.TPTEP1、miR-761与LATS2存在协调控制关系。2.TPTEP1通过抑制miR-761/LATS2对非小细胞肺癌细胞的侵袭发挥抑制作用。3.在NSCLC细胞中,TPTEP1/miR-761/LATS2轴参与了EMT的调控。