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研究背景国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）认定镍化合物是确认的环境致癌物。流行病学证据表明,长期慢性暴露于镍（nickel,Ni）可导致肺癌发病率增加。然而,镍诱导肺癌的机制尚未完全阐明。WIF1是一种抑癌基因,是Wnt/β-catenin信号通路的特异性抑制剂,已有的研究证据表明其表达水平下调与肺癌的发生发展存在一定的相关性。然而,WIF1是否在氯化镍（nickel chloride,Ni Cl2）致癌中发挥作用及机制目前尚不清楚。研究目的为探讨WIF1在镍诱导肺癌中的作用及潜在分子机制,本研究将人肺支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞长期慢性暴露于氯化镍,并建立了镍诱导恶性转化BEAS-2B细胞系（Nickel induced BEAS-2B cell Transformation,BNi T）模型,以此来探讨WIF1在镍诱导肺癌中的作用和分子机制。研究方法（1）为探讨WIF1基因在肺癌组织中的表达水平以及对肺癌患者预后的影响,采用GEPIA、UALCAN和GE-mini三个生物信息学数据库评估WIF1基因在肺癌组织中的表达水平,采用Kaplan-Meier Plotter数据库评估WIF1基因在肺癌患者中的预后价值。（2）为探讨WIF1基因和蛋白在氯化镍诱导BEAS-2B细胞恶性转化中的作用,采用Western Blot和q RT-PCR检测BEAS-2B细胞暴露于氯化镍后,细胞内WIF1的蛋白和m RNA表达水平;通过转染过表达WIF1质粒来上调细胞内WIF1的表达水平,采用wound healing实验和平板集落实验来评估WIF1对BNi T细胞迁移和增殖能力的影响;采用Western Blot检测Wnt3a、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平,使用细胞免疫荧光实验检测β-catenin蛋白的分布和含量。（3）为探讨氯化镍是否通过诱导启动子甲基化影响WIF1的表达,采用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza处理细胞,使用Western Blot检测WIF1、Wnt3a、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平。（4）为探讨m~6A去甲基酶ALKBH5在氯化镍诱导WIF1表达下调中的作用,采用q RT-PCR检测氯化镍暴露后细胞内m~6A调节酶的m RNA表达水平,使用Western Blot检测m~6A去甲基酶ALKBH5蛋白表达水平;通过转染sh-ALKBH5和OE-ALKBH5质粒来增加或减少细胞内ALKBH5的表达水平,采用q RT-PCR检测ALKBH5和WIF1的m RNA表达水平;采用Western Blot检测ALKBH5、WIF1、Wnt3a、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光实验检测β-catenin蛋白的分布和含量;采用RNA稳定性实验评估sh-ALKBH5后细胞内WIF1 RNA的稳定性;采用细胞划痕实验和平板集落实验来评估ALKBH5对BNi T细胞迁移和增殖能力的影响。研究结果1.与癌旁组织相比,WIF1基因在肺癌组织中低表达。WIF1低表达与肺癌患者预后不良显著相关。2.氯化镍暴露诱导WIF1表达下调:与对照组相比,氯化镍短期暴露诱导BEAS-2B细胞内WIF1蛋白和m RNA表达水平显著下调;与正常传代的细胞相比,氯化镍长期暴露诱导BEAS-2B细胞内WIF1蛋白和m RNA表达水平显著下调。3.过表达WIF1抑制BNi T细胞的迁移和增殖能力。4.WIF1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制氯化镍诱导BEAS-2B恶性转化:氯化镍暴露激活BEAS-2B细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,而过表达WIF1显著逆转氯化镍激活的Wnt/β-catenin信号通路。5.DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza不能逆转氯化镍诱导的WIF1表达下调。6.氯化镍暴露诱导m~6A去甲基酶ALKBH5表达上调:与对照组相比,氯化镍急性暴露诱导BEAS-2B细胞内ALKBH5蛋白表达显著上调;与正常传代的细胞相比,氯化镍长期暴露诱导BEAS-2B细胞内ALKBH5蛋白表达显著上调。7.氯化镍通过上调m~6A去甲基酶ALKBH5表达,降低WIF1 RNA的稳定性,从而激活Wnt/β-catenin信号通路:敲减ALKBH5后,WIF1表达显著上调并抑制Wnt/β-catenin信号通路;过表达ALKBH5后,WIF1表达显著下调并激活Wnt/β-catenin信号通路;与对照组相比,敲减ALKBH5的细胞中WIF1 RNA的中位半衰期显著延长。8.ALKBH5促进BNi T细胞的迁移和增殖能力:敲减ALKBH5显著抑制BNi T细胞的迁移能力,而过表达ALKBH5显著促进BNi T细胞的迁移能力;敲减ALKBH5显著抑制BNi T细胞的增殖能力,而过表达ALKBH5显著促进BNi T细胞的增殖能力。结论1.WIF1低表达与肺癌患者预后不良相关。2.氯化镍暴露诱导BEAS-2B细胞内WIF1表达降低,而且DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza不能逆转氯化镍诱导的WIF1表达下调。3.氯化镍可能通过上调m~6A去甲基酶ALKBH5表达降低WIF1 RNA稳定性,下调WIF1的表达,从而激活Wnt/β-catenin信号通路诱导BEAS-2B细胞恶性转化。