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代谢是机体生命活动最主要的特征之一,正常细胞主要的供能方式是葡萄糖的有氧氧化,而肿瘤细胞为了维持自身生存,选择了另一种能量代谢方式——有氧糖酵解。肿瘤细胞能量代谢的改变(糖代谢重编程)在肿瘤发生发展中具重要作用,被认为是肿瘤的十大特征之一。已有研究证明,癌基因的活化或抑癌基因的失活能够导致肿瘤细胞发生代谢重编程。Cripto-1又称畸胎瘤衍生生长因子1(teratocarcinoma-derived growth factor1,TDGF-1),主要表达于胚胎发育的早期阶段,在成年期正常细胞中不表达或低表达,但在肿瘤细胞中高表达,能够促进细胞增殖、侵袭、迁移、血管生成以及EMT等,与肿瘤发生密切相关。但Cripto-1是否参与了肿瘤细胞的代谢重编程尚不清楚,因此深入研究Cripto-1对细胞糖代谢的影响具有重要意义。在本研究中,我们首先筛选了Cripto-1高表达与Cripto-1低表达的细胞系,利用western blot法在蛋白水平上检测出Cripto-1在Huh7和Bel7402细胞中高表达,而在L02细胞中低表达。因此,在后续的研究中,我们在Cripto-1高表达的细胞系Huh7和Bel7402中敲低Cripto-1,在Cripto-1低表达的细胞系L02中过表达Cripto-1,从而分析Cripto-1对细胞糖代谢产生的影响及其分子机制。1.Cripto-1对细胞糖代谢的影响为了研究Cripto-1对细胞糖代谢的影响,我们在Cripto-1低表达的细胞系L02中过表达Cripto-1,之后分别通过2-NBDG摄取实验、乳酸检测、乳酸脱氢酶活性检测和western blot法检测了Cripto-1对细胞葡萄糖摄取、乳酸分泌、乳酸脱氢酶活性以及细胞内各糖代谢相关蛋白表达的影响。结果显示,无论用高糖培养基,还是用低糖培养基培养,过表达Cripto-1都能促进细胞对葡萄糖的摄取、促进细胞的乳酸生成、增强细胞的LDH活性并能促进细胞内糖代谢相关蛋白HK2、GLUT1、PKM2和LDHA的表达;而在Cripto-1高表达的细胞系Huh7和Bel7402中敲低Cripto-1,用高糖培养基或低糖培养基培养均抑制了细胞对葡萄糖的摄取、抑制细胞的乳酸生成、降低细胞的LDH活性并能够抑制细胞内糖代谢相关蛋白HK2、GLUT1、PKM2和LDHA的表达。以上结果表明,Cripto-1在一定程度上促进了细胞的有氧糖酵解。2.Cripto-1促进细胞有氧糖酵解的机制研究通过上述研究发现,Cripto-1可以促进细胞发生有氧糖酵解,但其具体机制尚不清楚。为了进一步探讨Cripto-1对细胞糖代谢影响的机制,我们利用Western blot方法分别检测了过表达或敲低Cripto-1表达的情况下,细胞内MAPKs、NF-κB、PI3K-AKT等糖代谢相关信号的变化。结果显示,过表达Cripto-1能够显著激活p38/MAPK信号通路,而敲低Cripto-1的表达则抑制了p38/MAPK信号。随后我们在Cripto-1低表达的细胞系L02中过表达Cripto-1,并用p38/MAPK抑制剂(SB203580)和p38/MAPK的显性负性突变体(DN-p38)抑制p38/MAPK信号,检测其对Cripto-1过表达的L02细胞糖代谢的影响。结果显示,不同浓度的p38抑制剂(SB203580)或DN-p38会抑制过表达Cripto-1细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、LDH活性以及各糖代谢相关蛋白的表达。以上结果提示,Cripto-1促进细胞发生有氧糖酵解至少有一部分是通过激活p38/MAPK信号通路来完成的。3.Cripto-1促进细胞发生有氧糖酵解的作用与其促细胞增殖作用之间的相关性研究本课题组前期的研究发现,Cripto-1能够促进细胞增殖,我们首先对这一结论进行了验证。在Cripto-1低表达的细胞系L02中过表达Cripto-1,之后利用MTT实验与BrdU掺入法检测了Cripto-1对细胞增殖的影响,并利用ATP检测试剂盒检测了细胞中的ATP含量。结果显示,过表达Cripto-1能够增强细胞的活力,增加DNA的合成,并促进细胞能量的生成;反之,在Cripto-1高表达的细胞系Huh7和Bel7402中敲低Cripto-1的表达则抑制了细胞DNA的合成、降低细胞活力并抑制细胞的能量生成。以上结果证明,Cripto-1能够促进细胞增殖与能量生成。为了阐明Cripto-1对细胞糖代谢的调控作用与其促细胞增殖作用之间是否存在相关性,我们使用糖酵解阻断剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)阻断细胞糖酵解,检测其对过表达Cripto-1的L02细胞的2-NBDG摄取、乳酸生成、乳酸脱氢酶活性、细胞增殖、细胞活力以及ATP含量的影响。结果显示,使用糖酵解阻断剂2-DG后,细胞糖酵解明显被抑制,而且细胞活力及细胞DNA合成均明显减弱。而且,使用糖酵解抑制剂2-DG抑制糖酵解对L02细胞过表达Cripto-1组的细胞糖代谢、细胞活力及细胞增殖的抑制效果明显强于对照组。以上结果说明,Cripto-1促进有氧糖酵解作用与其促细胞增殖作用之间具有明显的相关性,提示Cripto-1可能是通过促进有氧糖酵解作用来促进细胞增殖的。综上所述,本研究初步探讨了Cripto-1对细胞糖代谢的影响及其促细胞增殖作用之间的相关性,从而为以Cripto-1为靶点的肿瘤治疗提供了实验依据。