基因治疗作为现代医学领域发展起来的一项新技术,通过将基因物质运输到特定细胞对疾病进行治疗。分子生物技术的发展和人类基因组计划的完成使更多的致病基因得到确认,这为许多疾病的治疗提供了可能,比如血友病、肌肉萎缩症、心血管疾病、癌症等。虽然基因治疗引起人们越来越多的关注,然而基因药物的研究仍然进展缓慢,缺乏高效的基因传递系统是重要原因之一。常用的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有很高的转染效率,在基因治疗中应用广泛。但是病毒载体缺乏靶向性,生产成本高昂,具有极大的安全隐患,限制了它在临床实验中的进一步应用。非病毒载体具有安全性较高,载体分子容易修饰,适合大量生产等优点,具有很好的应用前景。目前,阳离子高分子聚合物载体是研究的热点。阳离子高分子作为基因载体性能良好,但是转染效率不高、细胞毒性较大这两个缺点仍然限制了阳离子高分子载体的进一步发展。阳离子高分子载体转染效率不高,主要原因是不能很好的介导DNA在细胞内进行传递(从内体中逃逸出的质粒DNA量少；质粒DNA缺乏保护而被内源性核酸酶降解；进入细胞核进行表达的质粒DNA量少)。因此,设计新型阳离子高分子,降低细胞毒性,提高转染效率使其更好的应用于基因的负载和传递,对于基因治疗尤为重要。本文在第一章中概述了基因治疗发展情况,详细介绍了常用的阳离子高分子聚合物基因载体,总结了目前基因治疗中存在的障碍和已有的解决方法。在余下的六章中,我们通过合成或者构建的方法,制备了一系列不同类型的阳离子高分子聚合物载体,系统研究了这些载体的物理化学性质及生物性能。在第二章中,我们利用原子转移自由基聚合合成了两嵌段聚合物聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PEG-PGMA),并用乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺和分子量为400的聚乙烯亚胺修饰聚合物,得到一系列具有不同胺基结构的PEG-PGMA-oligoamines。我们利用核磁共振氢谱和元素分析表征聚合物的结构,发现PEG-PGMA在引入胺基的过程由于多个胺基的存在,造成了分子间和分子内不同程度的交联,并且交联度与引入的烷烃胺的链段长度有关。我们利用酸碱滴定法测定所得聚合物的缓冲能力,其中PEG-PGMA-PEI400的缓冲能力最强。正电性的PEG-PGMA-oligoamines能够和DNA结合形成复合物,在N/P为2.5时,所有PEG-PGMA-oligoamines都能够阻止DNA的电泳运动。我们用动态光散射法考查了PEG-PGMA-oligoamines/DNA复合物的粒径和电势,发现复合物的粒径和电势与接枝的烷烃胺以及PGMA的链段长度有关。细胞毒性实验表明PEG-PGMA-oligoamines系列聚合物都具有很好的生物相容性,对293T细胞的毒性均比25 kDa bPEI低的多。PEG-PGMA-oligoamines能够介导荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因在293T细胞中转染,转染效率要比25 kDa bPEI低一个数量级。PEG-PGMA-oligoamines在10%的血清中的转染能力与25 kDa bPEI相当,这可能是因为bPEI在血清中的转染能力受到血清中的蛋白质和其它阴离子的干扰,而PEG-PGMA-oligoamines能够通过PEG的空间位阻作用保持其与DNA复合物在血清中的稳定性。转染实验结果证明PEG-PGMA-oligoamines (?)勺转染能力与其缓冲能力密切相关。在第三章中,为了进一步提高PGMA阳离子衍生物的转染能力,我们首先利用原子转移自由基聚合在PGMA链段中引入疏水链段聚丙二醇(PPO),合成了BAB型三嵌段聚合物PGMA-PPO-PGMA,然后我们用不同比例的Boc基团保护的乙二胺(Boc-EDA)和1-(3-胺基丙基咪唑)(API)修饰聚合物,得到一系列侧链带有不同比例乙二胺和咪唑基团的PGMA-PPO-PGMA阳离子衍生物。我们希望聚合物中引入的疏水链段PPO能够增强聚合物与细胞膜的作用能力,同时通过接枝不同比例的EDA和咪唑基团,调节聚合物的缓冲能力和与DNA结合的能力,最终达到最优化的条件,得到具有最高转染能力的聚合物。我们用核磁共振氢谱和红外光谱表征了PGMA-PPO-PGMA阳离子衍生物的结构,确定了衍生物中引入的EDA和咪唑基团的比例,发现EDA和咪唑基团的比例与投料比基本相当,聚合物没有发生交联。PGMA-PPO-PGMA阳离子衍生物可以与DNA结合形成复合物,我们通过凝胶电泳实验和动态光散射对复合物的性质进行了表征。我们发现,阳离子和复合物的结合能力,复合物的表面电势和粒径大小与PGMA-PPO-PGMA衍生物中EDA和咪唑基团的比例有关,EDA的含量越高,聚合物对DNA结合能力越强,复合物电势更高。细胞毒性实验表明,PGMA-PPO-PGMA衍生物对293T细胞毒性较小,远远低于25 kDa bPEI,并且衍生物中EDA含量越高,聚合物毒性越大。PGMA-PPO-PGMA阳离子衍生物介导荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因在293T细胞中转染的实验结果表明,EDA和API比例为16/141的PGMA-PPO-PGMA衍生物具有与25 kDa bPEI相当的转染效率,并且在血清中,转染效率比25 kDa bPEI高一个数量级,充分显示了其在体内应用的前景。根据第二章和第三章的实验结果,我们发现PGMA阳离子衍生物聚有很好的生物相容性,并且在血清中的转染能力接近甚至超过25 kDa bPEI,这与许多文献中报道的甲基丙烯酸类阳离子基因载体的性质不一致。我们推测这是由于PGMA侧链高密度的羟基造成的。在第四章中,我们分别用氨水和Boc-EDA与PGMA均聚物反应,得到聚(甲基丙烯酸3-胺-2-羟基丙基酯)(PAHPMA)和聚(甲基丙烯酸3-(胺基乙基胺)2-羟基丙基酯)(PAEAHPMA),并合成了与PGMA具有相似结构单元数的聚甲基丙烯酸胺乙基酯(PAEMA)和聚(甲基丙烯酸2-(胺基乙基胺)-乙基酯)(PAEAEMA)。这四种聚合物结构单元数和化学结构相似,只有PGMA衍生物侧链多了羟基官能团。我们利用这四种聚合物,考察了甲基丙烯酸类基因载体侧链羟基对其化学和生物性能的影响。肝素置换实验结果表明PAHPMA和PAEAHPMA侧链的羟基有利于聚合物和DNA的复合,电势的测量结果表明,PAHPMA和PAEAHPMA侧链羟基的存在使其表面电势低于PAEMA和PAEAEMA,而聚合物在293T细胞中的毒性实验表明,PAHPMA和PAEAHPMA生物相容性更好,细胞毒性更低。在293T细胞中的转染实验表明,非血清条件下PAHPMA和PAEAHPMA的转染效率要低于PAEMA和PAEAEMA。这可能是因为羟基的存在使PAHPMA和ⅠPAEAHPMA具有弱的电势和强的DNA复合能力,影响了复合物的细胞吞噬和DNA在细胞内的释放；在血清条件下,PAHPMA和ⅠPAEAHPMA的转染效率与其非血清条件下相当,而PAEMA和PAEAEMA的转染效率明显降低。这可能是因为羟基的存在提高了聚合物在血清中的稳定性。在第五章中,我们对PAEMA阳离子进行改性,合成了具有不同阳离子链段分子量的两亲性三嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚甲基丙烯酸胺乙基酯(PEG-PCL-PAEMA),并将其作为基因载体,考察其相关性质。我们同时合成了PEG-PAEMA和PCL-PAEMA两种阳离子聚合物,将其与PEG-PCL-PAEMA进行对比,考察PEG嵌段和PCL嵌段的功能。根据核磁和凝胶渗透色谱结果,我们计算出合成聚合物的结构分别为PEG-PCL-PAEMA25、PEG-PCL-PAEMA50和PEG-PCL-PAEMA100以及PEG-PAEMA105和PCL-PAEMA95。PEG-PCL-PAEMAs在水中自组装成以PCL为核,以PEG和PAEMA为壳的阳离子胶束,阳离子胶束可以与DNA结合,形成复合物。凝胶电泳实验结果表明不同PAEMA分子量的阳离子胶束与DNA的结合能力相近。粒径和电势的结果表明PEG-PCL-PAEMAs能够与DNA形成粒径在320±40 nm表面电势为35±10 mV的纳米粒子。在COS7细胞中的毒性实验表明,聚阳离子细胞毒性低于25 kDa bPEI。同时,以上实验结果还表明,疏水链段PCL能够使聚合物聚集增加其局部电势,致使聚合物与DNA的结合能力增强,而亲水链段PEG的存在能够有效地屏蔽复合物的表面电势,使复合物在血清中保持稳定。PEG-PCL-PAEMA100, PEG-PAEMA105和PCL-PAEMA95的蛋白吸附实验进一步验证了这些结论。聚阳离子介导荧光素酶在COS7细胞中的转染实验表明,PEG-PCL-PAEMA在血清中具有和25 kDa bPEI中相似的转染效率,并且在蛋白溶液中具有很好的稳定性。聚合物结构和聚合物生物性能二者关系的研究,为设计高效低毒的高分子基因载体打下了基础。在第六章中,我们利用聚离子复合胶束和生物素-亲和素桥键构建能够运载阿霉素(DOX)和基因的多功能靶向载体。我们用聚天冬氨或阿霉素接枝的聚天冬氨酸(DOX-PASP)与不同质量的聚(甲基丙烯酸2-(胺基乙基胺)-乙基酯)(PAEAEMA)通过静电作用结合,构成聚离子复合物胶束(PICs),这些PICs的粒径在180 nm-240 nm,在水溶液中稳定存在。PAEAEMA/PASP的比例为4/1和5/1时具有明显的正电性,能够和DNA形成复合物。细胞毒性实验表明PICs/DNA细胞毒性较小,而PICs-DOX/DNA能够抑制HeLa和HepG2癌细胞的生长。基因转染实验表明PICs在293T、HeLa和HepG2细胞中具有较好的转染能力。根掘细胞实验的结果,我们选用PICs-4/DNA重量比15进一步构建多功能载体。首先生物素化的聚乙二醇-聚谷氨酸通过静电作用力复合在PICs-4/DNA复合物表面,然后将生物素化的转铁蛋白(Biotinylated transferrin)通过生物素-亲和素之间的亲和作用力连接到聚乙二醇端基,得到靶向多功能载体TAB/PICs/DNA。实验结果表明TAB的加入降低了PICs/DNA复合物的电势和粒径,并不影响PICs和DNA的复合。细胞毒性实验结果显示,TAB/PICs-4D/DNA载体能够实现DOX在HeLa和HepG2癌细胞中的靶向表达,而荧光素酶表达结果则表明TAB/PICs-/DNA载体能够使荧光素酶在HeLa和HepG2癌细胞中靶向表达。我们激光共聚焦显微镜观测了TAB/PICs-4D/DNA载体中DOX和荧光蛋白在HepG2中的表达,我们发现PICs-4D能够表现出抗癌作用,荧光蛋白的表达同时得以实现。这些结果证明了了TAB/PICs-4D/DNA复合物可以作为靶向运输DNA和DOX的载体,这为构建多功能药物和基因载体提供了一个新的方法。