背景:头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC,以下简称头颈鳞癌）是最常见的头颈部恶性肿瘤,具有较强的局部浸润和转移能力,恶性程度往往较高。经过以手术、放化疗为主的综合治疗后,口腔颌面部鳞癌患者5年生存率达到60%左右,但晚期患者5年生存率仍徘徊在20%-40%上下。尽管新的多学科治疗模式从某种程度上改善了患者的预后,但多数患者就诊时已接近晚期。因而,提高口腔颌面部鳞癌患者的长期生存率是广大医务工作者面临的最大挑战,迫切需要对口腔颌面部鳞癌进行肿瘤关键基因的筛选和功能鉴定,寻找更有效的分子靶向目标来干预肿瘤的发生发展。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是原癌基因的表达产物,在 HNSCC 中常呈高表达,与肿瘤的临床分期、转移及患者预后密切相关。Erlotinib是喹唑啉类衍生物,可以选择性、可逆的抑制EGFR的活性。近十年来,Erlotinib已成为一线抗肿瘤治疗药物,并已在一些肿瘤病人中取得了显著的疗效。但在深入研究中发现,存在EGFR突变的细胞对Erlotinib治疗敏感性降低,预后较差。因此,如何有效的联合用药是当今肿瘤治疗热点问题。Notch1基因及其信号通路在人类的发育和肿瘤进展中发挥了重要的作用,其在人头颈鳞癌（HNSCC）中的突变率可高达40%,并与不良预后相关。PF-03084014作为γ-secretase抑制剂,可特异性抑制Notch1通路激活。近年来,研究发现EGFR突变型肺癌细胞系中存在干细胞样癌细胞的富集,该细胞可通过Notch通路激活来抵抗药物作用。本实验中我们通过联合使用Notch1特异性抑制剂PF-03084014及EGFR抑制物Erlotinib,观察其对HNSCC细胞系的增殖、侵袭、凋亡等的影响,并探究其相关机制,降低由单一用药导致的肿瘤耐受,抑制肿瘤生长。研究目的:1、观察单一应用及联合使用Erlotinib与PF-03084014在体外及体内试验中对头颈鳞癌细胞增殖能力的影响;2、观察单一应用及联合使用Erlotinib与PF-03084014对头颈鳞癌细胞侵袭能力的影响;3、明确联合使用Erlotinib与PF-03084014在体外及体内对头颈鳞癌细胞凋亡的影响;4、探讨Notch1与EGFR通路间的交互作用及联合用药对头颈鳞癌细胞作用的分子生物学机制。材料与方法:1、CCK-8法检测细胞生长,计算单一用药后各细胞系的半抑制浓度（IC50）;应用 Western blot 验证 PF-03084014、Erlotinib 对 Notch1、EGFR 通路的抑制作用。2、体外培养人头颈鳞癌细胞系,运用PF-03084014及Erlotinib对其干预后,应用CCK-8法、克隆形成实验检测联合用药后细胞增殖能力变化;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化;流式细胞术、Tunel染色、cleaved Caspase-3免疫荧光染色检测细胞早期凋亡。3、构建裸鼠移植瘤动物模型,观察单一及联合给药后肿瘤生长的大小变化;Ki-67、Tunel染色观察肿瘤增殖及凋亡水平差异;Notch1、p-EGFR染色检测给药后两通路的变化。4、应用Western blot研究两抑制剂对EGFR下游信号通路的影响,探索两通路间的交互作用。结果:1、通过计算发现,Erlotinib的IC50值在0.1至20 μM之间,PF-03084014的IC50值在20至35μM之间;在IC50浓度,各细胞系均表现出对Notch1及EGFR通路的完全抑制作用。2、在HN6及CAL27细胞系中,Erlotinib、PF-03084014在一定浓度范围内可增强细胞的增殖及侵袭能力;与单一用药相比,联合给药可显著抑制细胞的增殖及侵袭能力,并能明显诱导细胞的早期凋亡。3、通过构建HNSCC裸鼠移植瘤模型发现,联合给药能够明显抑制肿瘤的生长并诱导组织的凋亡;在对组织进行免疫组化染色后发现,单一运用Erlotinib进行干预可使活性Notch1表达量明显增加,联合给药后活性Notch1受到抑制,提示PF-03084014可逆转Erlotinib导致的Notch1通路激活。4、在头颈鳞癌细胞系中使用PF-03084014进行干预后,Western blot实验提示p-EGFR表达量降低,p-AKT及PI3K表达量显著增加,提示EGFR下游通路激活;联合给药后EGFR下游通路受抑制,提示Erlotinib可逆转由PF-03084014导致的EGFR下游通路激活,揭示了两通路间的交互作用。结论:使用Erlotinib联合PF-03084014治疗可降低头颈鳞癌细胞系的增殖及侵袭能力,促进细胞的凋亡。与单一用药相比,联合给药可降低单一给药所致的原发性药物抵抗作用,为头颈鳞癌的治疗提供新的可能方法。