禽流感是由正黏病毒科A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病,一旦爆发,不仅会给养禽业带来巨大的经济损失,也会对世界公共安全卫生构成威胁。目前,对鸡群进行免疫是当前控制禽流感爆发最常用的措施,但由于禽流感病毒含有多种亚型,且病毒的变异速度很快,所以疫苗免疫很难达到理想的防治效果,因此,通过导入免疫相关基因或针对禽流感病毒的特异性shRNA,制备抗禽流感转基因家禽,使家禽个体本身具有抵抗禽流感病毒的能力,从而有效抑制禽流感病毒的复制和在家禽个体间的传播,具有重大科学意义和应用价值。为成功制备抗禽流感家禽,本课题从抗禽流感转基因载体构建和鸡转基因技术优化等两个方面进行了研究。第一方面,抗禽流感双表达慢病毒载体的构建。从鸭子体内克隆免疫调控基因RIG-I的cDNA,构建了该基因的真核表达载体CS-RfA-EG-RIG:同时,根据禽流感病毒基因的保守序列设计构建了pENTR4-H1-DP1-DP5等6种shRNA表达载体,并利用模拟禽流感病毒复制的荧光素酶报告基因系统,通过培养细胞上的干扰试验,筛选出了效果最好的shRNA表达载体pENTR4-H1-DP1;在此基础上,凭借Gateway LR反应将shRNA表达序列HI-DPI转移至CS-RfA-EG-RIG载体,从而构建成功了表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的双表达载体CS-RfA-EG-DP1-RIG。将该载体导入293T细胞,利用荧光定量PCR检测到了RIG-I mRNA的超表达；与模拟禽流感病毒复制的报告基因系统5种质粒共转染293T细胞,荧光素酶检测结果表明CS-RfA-EG-DP1-RIG载体同时具有抑制禽流感病毒复制的功能。这一研究为抗禽流感转基因鸡的制备提供了重要的材料基础。第二方面,提高鸡转基因效率方法研究。胚盘下腔慢病毒注射法虽然是目前最为有效的鸡转基因方法,但存在着基因导入效率低、难以获得转基因后代的技术瓶颈。为此,本研究设计了旨在提高胚盘细胞慢病毒感染效率的两条技术路线。首先,利用胰酶将胚盘细胞消化分散,同时注射病毒,使大量胚盘细胞能够接触到病毒。实验结果表明：0.25%胰酶注射至鸡胚盘,可使胚盘细胞呈分散状态,且在开始孵化后能够重新聚集,不影响鸡胚正常发育；胰酶处理鸡胚后再注射表达荧光蛋白的重组慢病毒,孵化4天后,胚胎细胞中呈荧光阳性的细胞比率为0.22%,而直接注射慢病毒的鸡胚中荧光阳性细胞占0.29%,表明胰酶处理对提高鸡胚的病毒转染率作用不显著,其原因在于慢病毒接触胰酶后其生物学滴度受到影响,因此,采取保护措施使病毒免受胰酶处理影响将是今后研究的课题。其次,将已注射慢病毒的种蛋在16℃、22℃和28℃条件下放置24小时,再转移到38.5℃温度下进行孵化,孵化到第4天将鸡胚用0.25%胰酶消化成单个细胞,观测了鸡胚中荧光阳性细胞的比率。注射慢病毒后直接放入孵化箱的对照组平均每1000个细胞中仅有1个细胞观察到荧光(0.09%),而16℃、22℃和28℃实验组分别达到2.30%、0.86%和0.55%。结果表明：鸡胚注射慢病毒后16℃下放置24小时使基因转染效率较直接孵化的常规方法提高了20倍,利用这一改进措施可望获得高度嵌合的转基因鸡。本研究制备了能够同时表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的慢病毒载体,并探索了提高鸡胚转基因效率的可行办法,为下一步成功制备抗禽流感转基因鸡奠定坚实的基础。