作物病原线虫危害严重,植物寄生线虫作为重要的病原物,其种群增长迅速,防治困难。由于传统的防治方法的局限性和现在人们环保意识的增强,人们更加青睐高效、绿色、环境友好的生物防治。由于细菌生长快、易于培养且对线虫有较好的杀灭作用,已成为生物防治线虫的重点。杀线虫芽孢杆菌B16（Bacillus nematocida B16）对多种植物寄生线虫具有杀灭活性,其在线虫肠道内的成功定殖是完成侵染和获得最大生防效率的关键因素。前期研究从线虫肠道分离得到一株内生菌SCO41（Phytobacter diazotrophicus）,发现其能在体外抑制B16的生长,体内抑制B16的定殖,主要的抑制因子为鞭毛蛋白P1（flagellin Fli C）。但其对B16作用的分子机制尚不清楚。文献查阅发现细菌鞭毛蛋白可与Toll-like receptor 5（TLR5）特异性结合,从而触发宿主的先天免疫应答。此反应常见于真核生物,在原核生物中未见报道。那么鞭毛蛋白P1与B16之间是否也存在类似的结合呢?目前尚不清楚。本研究选取杀线虫芽孢杆菌B16、重氮营养植物杆菌SCO41为研究对象,利用活性测试、FITC荧光标记、蛋白质组学分析和分子生物学等方法探究重氮营养植物杆菌SCO41分泌的鞭毛蛋白对杀线虫芽孢杆菌B16定殖障碍的机制,从而以全新的视角阐释线虫内共生菌、病原菌和宿主三者之间的互作关系,以通过基因工程的手段改造B16,增强其在自然条件下的适应性和防御内生菌的抵抗作用,从而增强其杀线虫活性。本研究的主要结果如下:1.鞭毛蛋白P1对B16的活性测试及定位分析。P1的生物活性测试包括体外对B16的抑菌活性测试和形态变化观察。抑菌活性测试表明重组蛋白P1对B16有明显抑制效果。形态变化观察表明蛋白缓冲液处理的B16细胞形态正常,纯化蛋白P1和重组蛋白P1处理的B16细胞变的细而长,部分细胞变弯曲。定位实验发现B16细胞膜上和细胞内均出现绿色荧光,细胞分裂处荧光强度显著增强,表明鞭毛蛋白P1可作用于B16的细胞膜上和细胞内,尤其是细胞分裂部位。结果表明鞭毛蛋白P1可能通过影响B16的正常分裂来抑制B16在线虫肠道内的定殖。2.蛋白质组学分析。提取P1处理B16前后的总蛋白,应用iTRAQ技术分析P1处理的对照和实验组中B16差异蛋白的表达。发现重组蛋白P1处理4 h和24 h后,B16分别有203个和506个蛋白表达上调,124个蛋白表达同时上调。上调的蛋白分为核糖体蛋白、脱氢酶、转移酶、延长因子等。重组蛋白P1处理4 h和24 h后,B16分别有16个和541个蛋白表达下调。下调的蛋白分为芽孢形成相关蛋白、转移酶、脱氢酶、肽酶、结合蛋白等。重组蛋白P1处理B16 24 h后,延长因子蛋白表达显著上调,与芽孢萌发、形成和氧化应激相关蛋白的表达显著下调,表明鞭毛蛋白P1主要与代谢和应激反应等生物学过程有关。KEGG通路富集分析表明,差异蛋白参与糖酵解、细菌感染、HIF-1信号通路和双组分系统过程。结果表明,鞭毛蛋白P1可能通过降低B16对外界环境胁迫的适应能力来抑制B16的活性,从而达到抑制B16在线虫肠道定殖的目的。3.qPCR验证差异蛋白表达量变化。对差异表达蛋白进行qPCR验证,发现重组蛋白P1处理B16后,延长因子相关基因fus A、tuf、tsf、gre A、efp相对表达量显著上调,芽孢形成相关基因spo0A相对表达量显著下调。芽孢计数实验和芽孢染色实验表明P1处理B16 24 h后芽孢形成数目减少,即P1抑制了B16芽孢的生成。结果表明,鞭毛蛋白P1可能通过抑制B16形成芽孢,来影响B16相应的生命活动,从而抑制B16在线虫肠道内的定殖。4.分子对接分析。FITC荧光标记表明P1可作用于B16细胞膜上和细胞内。利用iTRAQ蛋白组学数据筛选B16的膜蛋白和激酶,并将其与B16全基因组数据对比分析,获得膜蛋白和激酶的蛋白序列。从蛋白质数据库检索三维结构,使用ZDOCK进行蛋白与蛋白的分子对接,寻找到P1作用于B16的三种潜在受体蛋白。ZDOCK分析的输出结果表明,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、膜蛋白插入酶YidC、膜蛋白CydB和P1的ZDOCK得分分别为1668.462、1945.839、1994.676。结果表明P1可能与B16中的激酶和膜蛋白结合,影响B16的生长、分裂和细胞功能,从而抑制B16线虫在肠道中的定殖。综上所述,鞭毛蛋白P1可能通过影响B16的正常分裂,来抑制其在线虫肠道内的定殖;也可能通过降低B16对外界环境胁迫的适应能力,来影响B16的活性,从而抑制B16在线虫肠道内的定殖。P1可作用于B16的细胞膜上和细胞内,其可与B16的潜在受体蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、膜蛋白插入酶YidC和膜蛋白CydB结合。P1与B16三种潜在受体蛋白结合界面上氨基酸残基的相互作用,也为后续研究P1与B16特定位点蛋白作用的分子机制奠定了基础。