嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是在全世界范围内流行的一种条件致病菌,给水产养殖业和人类健康带来了严重危害。抗生素是防治嗜水气单胞菌的主要手段,在我国每年投入多于5000吨的四环素类抗生素（包括了土霉素、四环素和金霉素等）用于养殖业中。土霉素因其效果好、毒性小、代谢快等特点直接作为鱼药添加剂加入饲料中。大量的耐土霉素菌株的产生大大降低了它的作用效果,在开发新药成本越来越高的情况下,如何让现有的药物经久有效使用成为研究的热点问题。现有的研究主要集中在嗜水气单胞菌对四环素类固有耐药基因的检测及疫苗的研发,而对其应激耐药和获得性耐药之间的联系以及毒力因子与耐药之间的关系有待深入研究与揭示。作者分别从应激耐药和获得性耐药两方面来研究嗜水气单胞菌对土霉素的耐药机制,首先利用低剂量的土霉素诱导Aeromonas ATCC 7966（简称Ah）获得一株具有稳定遗传的耐土霉素菌株OXY-R,比较了Ah与OXY-R在基因水平和蛋白水平上的差异,揭示基于基因突变的获得性耐药机制;其次比较了土霉素应激下Ah的全蛋白和外膜蛋白的表达差异,分析土霉素应激条件下Ah的代谢变化,揭示应激耐药与获得性耐药的可能联系;然后利用分子生物学技术对部分耐药关键蛋白进行功能验证;最后利用毒力因子疫苗和外排泵抑制剂对嗜水气单胞菌的防治进行初步研究。主要内容和结果如下:1.嗜水气单胞菌获得性耐药机制的研究通过浓度梯度倍增的方法加入抗生素OXY诱导敏感菌Ah经过10代后,获得具有稳定遗传的耐药菌OXY-R,MIC由2.5 μg/mL提高到了 40 μg/mL。利用全基因组重测序技术比较了敏感菌Ah和耐药菌OXY-R的全基因组,分析发现耐药菌在外膜蛋白、耐药基因和毒力因子等分类存在大量的SNP突变,暗示了获得性耐药机制可能与这些方面有关。通过定量蛋白质组学实验分析了敏感菌Ah和耐药菌OXY-R在不加抗生素的条件下膜蛋白的差异,发现在蛋白质翻译过程和运输运动过程中表达上调,代谢过程表达下调。2.嗜水气单胞菌应激蛋白质组学研究利用比较蛋白质组学的方法,研究了 Ah在不同土霉素浓度的胁迫下全蛋白及外膜蛋白的表达差异。结果表明,在全蛋白中,利用iTRAQ标记和SWATH-MS两种质谱技术共获得238个重叠差异蛋白,分析发现与翻译过程相关的蛋白表达上调,而与能量代谢（糖酵解和TCA循环）相关的蛋白表达下调。在外膜蛋白中,利用TMT标记质谱技术进行两次生物学重复共鉴定了 259个重叠蛋白,差异蛋白主要富集在核糖体过程途径、β-内酰胺酶耐药途径和氧化磷酸化途径。3.嗜水气单胞菌对土霉素应激耐药与获得性耐药的比较比较分析了应激耐药和获得性耐药两种机制的异同,认为两种机制在翻译过程中均上调表达,在能量代谢过程中均下调表达,而在毒力因子和外膜蛋白特别是外排泵系统中存在差异。NAD+和NADH检测结果及TCA循环相关两种酶活性的测量数据验证了能量代谢过程下调的结果。攻毒实验结果显示OXY-R菌株的毒性要强于Ah,毒力因子与耐药之间存在相关性。qPCR实验验证了OXY-R菌株和Ah菌株在不同浓度土霉素的胁迫下,RND外排泵蛋白的表达水平存在差异。4.嗜水气单胞菌耐药关键蛋白的功能验证筛选了 14 个关键蛋白（包括 AcrA、LamB、MurA、SurA、BamE、MrcA、OprM、A0KJZ6、A0KN99、AOKHF7、AOKLQ6、AOKPL3、AOKR20和AOKMB2）进行功能验证。通过E.coli的P9表达系统成功构建14个过表达菌株,其中9个菌株对OXY的MIC与转入空载体的对照菌株MIC出现差异,说明这些蛋白在耐药过程中起关键作用。LamB和AOKLQ6的作用最明显,其中LamB蛋白的过表达菌株MIC下降至对照的1/4,说明该蛋白在参与耐药过程中起负调控作用,AOKLQ6蛋白的过表达菌株MIC上升至对照的4倍,说明该蛋白参与耐药过程中起正调控作用,序列比对发现AOKLQ6蛋白属于TolC蛋白家族。5.嗜水气单胞菌防治的初步研究根据比较分析,认为毒力因子和RND外排泵在嗜水气单胞菌耐药机制中起到关键作用,可针对性地对其进行防治。一方面进行毒力因子疫苗的筛选,将包括AcrA、MurA、SurA、AOKLQ6、AOKHF7、A0KN99和AOKPL3在内的6种毒力因子制备成疫苗对斑马鱼进行免疫,测定其免疫保护率,结果显示AcrA、AOKLQ6、AOKHF7、A0KN99和AOKPL3对感染了A.hydrophila的斑马鱼具有良好的保护率,可进行后续试验进一步筛选。另一方面针对RND外排泵的抑制剂进行筛选,选用利血平、N-甲基吡咯烷酮及4种中药（黄芪、黄连、板蓝根和连翘）进行抑菌效果和耐药抑制效果实验。结果显示利血平的抑菌效果和耐药逆转效果最好,根据Western blotting结果推测分析利血平是通过抑制AcrA蛋白的表达而降低AcrAB外排泵系统对土霉素的排出,从而达到逆转耐药的效果。本研究系统分析了嗜水气单胞菌应激耐药及获得性耐药的异同点,认为这两种机制虽然并非两个独立的过程,抗生素既可以诱发应激反应也可以诱发耐药性,而应激反应可以激活相关耐药基因的表达来应对不利环境,其中RND外排系统是革兰氏阴性菌获得性耐药的决定因子。研究发现毒力因子与耐药之间存在相关性,但不同的菌株对不同的抗生素而言,毒力基因与耐药性之间的关系较复杂,无法笼统地总结为正相关或是负相关关系。