LncRNA MEG3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞自噬的影响

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pollyzhang15
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研究目的:  探究人类长链非编码RNA母系表达基因3(MEG3)在上皮性卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞自噬的影响。  研究方法:  1.采用荧光定量PCR检测MEG3在23例上皮性卵巢癌组织、16例正常卵巢组织及四株上皮性卵巢癌细胞(OVCAR3、A2780、SKOV3和HO-8910)中的表达;并分析部分临床病理参数(FIGO分期、组织分级及类型)中MEG3的表达差异。  2.以正常卵巢组织中的cDNA为模板,根据GenBank提供的MEG3基因序列(NR_002766.2)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,先由DNA限制性内切酶KpnⅠ与EcoRⅠ双酶切,经T4DNA连接酶连接,确保MEG3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中以后,再利用PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定重组质粒。  3.体外瞬时转染细胞实验分三组:实验组,转染pcDNA3.1(+)-MEG3重组质粒;阴性对照组,转染pcDNA3.1(+)空质粒;空白对照组,转染磷酸盐缓冲液(PBS)。采用荧光定量PCR检测转染24h、48h、72h后OVCAR3细胞中MEG3和Atg5mRNA表达变化;采用透射电镜观察OVCAR3细胞超微结构的变化;采用单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色,倒置荧光显微镜下观察自噬囊泡;采用免疫印迹检测自噬关键基因Beclin1、Atg5和LC3的蛋白表达水平。  研究结果:  1.MEG3在上皮性卵巢癌中表达水平较低,相对于正常卵巢组织表达量(2-△△CT)为0.138±0.15,差异有统计学意义(p<0.05)。上皮性卵巢癌组织中,FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期的卵巢癌患者MEG3表达明显低于Ⅰ~Ⅱ期,差异有统计学意义(p<0.05);MEG3在卵巢癌患者不同组织分级和组织学类型之间,差异均无统计学意义(P>0.05)。  2.MEG3在OVCAR3、A2780、SKOV3和HO-8910细胞中均有表达,其中在OVCAR3细胞中的相对表达水平最低,与其他三株细胞之间,差异均有统计学意义(p<0.05)。  3.经PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序证实pcDNA3.1(+)-MEG3重组质粒构建成功。  4.体外瞬时转染24h、48h、72h后,实验组MEG3、Atg5mRNA表达显著高于阴性和空白对照组,在48h达到峰值,差异具有统计学意义(p<0.05);透射电镜下实验组可见较多自噬小体形成;倒置荧光显微镜下实验组MDC阳性细胞比例明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05);免疫印迹显示实验组LC3-Ⅱ、Beclin1和Atg5的蛋白表达量明显高于阴性和空白对照组。  研究结论:  长链非编码RNAMEG3在上皮性卵巢癌组织中的表达水平较低,且与患者的FIGO分期相关,提示其可能参与卵巢癌的发生发展;体外瞬时转染MEG3质粒可促进OVCAR3细胞自噬囊泡和自噬小体形成,并提高自噬相关生化指标的表达水平,提示其可能促进上皮性卵巢癌细胞自噬的发生。
其他文献
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慢性荨麻疹(CU)是一类常见的皮肤病,表现为反复出现的红斑、风团伴瘙痒(可合并血管性水肿),持续至少六周以上。因其死亡率极低,治疗药物通常有效,很少伴其他器官或功能损害。故而,临