论文部分内容阅读
H5N1亚型高致病性禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）在我国最早于1996年在广东省首次被分离,命名为A/Goose/Guangdong/1/96（GD/96）。此后,GD/96-like病毒在我国多个地区流行并演变出众多基因型,又迅速扩散到亚欧大陆和非洲多个国家,引起大量禽鸟感染并死亡,造成全球各地养禽业重大的经济损失。不仅如此,H5N1还能够跨越种属障碍从禽直接传播到人,对公共卫生安全也造成了巨大的威胁。H5N1病毒变异速度极快,目前已进化出多个具有遗传和抗原差异的HA分支,并与多种亚型NA重配形成H5NX病毒,使得其防控形势愈发严峻。因此,加强H5病毒的流行病学监测并解析其进化变异规律、开发快速诊断制剂与疫苗产品,对于疫情的早期预警和有效防控而言显得尤为重要。本研究基于clade2.3.4.4与clade2.3.2.1两大进化分支H5亚型AIV在我国的长期优势流行,研制了针对HA蛋白和NP蛋白的单克隆抗体,并对其在病毒抗原性变异分析和广谱性检测中的应用进行了初步研究。1.Clade 2.3.4.4和clade 2.3.2.1 H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定选取流行分支 clade 2.3.4.4（QD1 株）、clade 2.3.4.4d（0205 株）、clade 2.3.2.1d（1033株）和clade 2.3.2.1e（HF9株）上的不同H5病毒,经灭活和超速离心等方法制备全病毒灭活疫苗,分别通过腹部皮下多点注射的方法对6周龄BALB/c小鼠进行三次常规免疫,再经腹腔注射的方式进行加强免疫,3天后取其脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合,制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制试验（Hemagglutinationinhibition,HI）和酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对融合孔进行筛选,阳性孔经过三次亚克隆后最终获得8株以0205、3株以1033、6株以HF9为免疫原的共计17株针对 HA 蛋白的阳性杂交瘤细胞系 2B2、2E10、4F3、6F4、6C11、5F2、4E3、7E9,1G10、2G5、3D9,3A6、6F6、6A5、6H2、5H4、7G3;以及 3 株以 QD1 为免疫原针对 NP 蛋白的阳性杂交瘤细胞系3D4、4B9、5F10。经测定,各HA单抗腹水的HI效价均在11～14 log2之间,中和价在1:508～1:28963之间;各NP单抗腹水的ELISA效价均在1:320000以上。进一步对这20株单抗进行特性鉴定,结果显示除2G5、6H2为IgA,其他均属于IgG类抗体;所有单抗在免疫荧光试验中均具有良好的反应原性;其中,3D9、1G10、6A5、3A6、7G3、5H4 的 HA 单抗和 3D4、5F10 的 NP 单抗在蛋白印迹（Western blot,WB）试验中能够分别与对应免疫原的HA蛋白、NP蛋白分别在75kDa、55kDa处发生特异性结合反应。2.H5亚型禽流感病毒HA蛋白单抗在抗原变异研究中的应用为了探究clade 2.3.4.4和clade 2.3.2.1 H5亚型AIV分支间和分支内的抗原性差异及其分子基础,选取分布于不同流行分支的43株H5亚型AIV与第一章中制备的17株HA单抗通过交叉HI试验进行排谱反应。结果显示,17株单抗与受试H5病毒的反应性各不相同,可将43株病毒划分为8个抗原型。进一步运用分子生物学软件Mega7.0对不同抗原型毒株的HA基因序列进行比对,其中单抗3A6、6F6、2G5及8株针对clade2.3.4.4免疫原的HA单抗与病毒反应结果指出,第205位（按H5计数）可能是引起抗原性改变的关键氨基酸位点;单抗6A5与病毒的反应谱筛选出了两组包含多位点的关键氨基酸突变,分别为第82、102、104、172、179、190、204位和第88、157、199位,并且两组位点在影响抗原性变异方面可能具有联合作用;单抗7G3和5H4又筛选出第156、200位;单抗3D9的不同反应性则表明第102和199位在影响抗原性变异方面也可能具有联合作用。3.H5亚型禽流感病毒NP蛋白单抗在广谱性检测中的应用鉴于NP蛋白是A型流感病毒中保守程度较高的蛋白,为了进一步评估第一章中制备的3株NP单抗在广谱性检测中的应用潜能,选取H1～H11不同HA亚型的AIV以及猪源、人源流感病毒及B型流感病毒感染MDCK细胞后进行间接免疫荧光试验。结果显示,3D4、4B9、5F10这3株NP单抗对不同HA亚型、不同宿主来源的A型流感病毒均具有良好的广谱性,而与B型流感病毒不反应,表明是A型流感病毒特异性。随后,对单抗腹水进行了 Protein G亲和层析柱纯化和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记,通过配对试验确定以纯化单抗3D4作为捕获抗体、HRP-4B9作为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。经过优化,最终确立捕获抗体最佳包被浓度为1.25 μg/mL、检测抗体最佳稀释倍数为1:8000;最佳反应条件为:捕获抗体以100μL/孔的量4℃过夜包被,选择1%的明胶进行封闭,以200 μL/孔的量37℃封闭2 h,待检抗原以100μL/孔的量37℃反应2h,捕获抗体以100μL/孔的量37℃孵育1 h,TMB反应15 min后终止并测定OD450nm值。对该双抗夹心ELISA检测方法评估结果显示,该方法在A型流感病毒的检测中特异性强、广谱性好;对H1N1的最低检出量为0.37102 TCID50/mL,对H9N2的最低检出量为0.98×102 TCID50/mL,灵敏度显著优于血凝试验（Hemagglutination,HA）;在临床样品检测试验中也未发生错检和漏检,表明该方法具有良好的实际应用前景。