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研究背景术后疼痛是手术后发生的急性疼痛,包括躯体痛和内脏痛,主要是由组织损伤时炎症细胞和神经末梢释放一系列的炎症介质（包括组胺、缓激肽、神经生长因子等）所致。术后疼痛可引起机体呼吸功能抑制、免疫功能减弱和心理障碍等症状,如果得不到及时有效地治疗,可能发展为慢性疼痛、神经病理性疼痛,极大地影响患者日后的生活。近年来研究显示,奖赏环路中的腹侧被盖区（Ventral tegmental area,VTA）和伏隔核（Nucleus accumbens,NAc）参与了镇痛的调节过程,腹侧被盖区细胞体的神经纤维投射到伏隔核,通过激活中脑腹边缘多巴胺（Dopamine,DA）神经元在疼痛产生中发挥进行调节,表明奖赏系统和镇痛的机制存在一定的关联。资料显示电刺激纹状体、伏隔核和腹侧被盖区域的多巴胺能神经元可减弱痛觉反应,选择性损伤多巴胺能神经元会导致动物痛觉过敏。表明多巴胺在奖赏系统调节疼痛过程中发挥重要作用。腹侧被盖区内注射吗啡和P物质类似物可以降低伤害感受,而向伏隔核中注射多巴胺受体拮抗剂可减少腹侧被盖区内注射吗啡或P物质类似物引起的镇痛效果。此外,强直性有害刺激可导致伏隔核中多巴胺的释放增加。表明腹侧被盖区的镇痛作用可能是通过神经纤维投射到伏隔核起作用的,但在术后疼痛中的分子机制尚未见文献报到。研究目的本研究通过制备小鼠切口痛模型,采用光遗传技术和D2受体拮抗剂,探讨腹侧被盖区多巴胺能神经元对伏隔核神经元调控在痛觉发生中的作用。方法1.实验动物:6-8周DAT-cre（Dopamine transporter,DAT）小鼠。动物来源:上海南方模式生物科技有限公司购买背景与C57B1/6相同的DAT-cre转基因动物,品系名称B6.SJL-Slc6a3tm1.1（cre）Bkmn/J。2.分组及处理:分组:将12只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组（C组）、模型组（P组）,n=6。将DAT-cre小鼠随机分为ChR2对照+模型组（PC组）、ChR2+模型组（P+ChR2组）、ChR2+DMSO组（ChR2+D）、ChR2+哌啶酮组（D2受体拮抗剂组ChR2+D2）、n=6。处理:模型组（P组）:进行左后足切口手术处理,n=6;对照组（C组）:假手术组,除了不进行左后足切口手术,其余处理同模型组相同,n=6;ChR2对照+模型组（PC组）:注射ChR2对照病毒,表达两周后进行后足切口处理,术后5天进行光刺激操作,n=6;ChR2+模型组（P+ChR2组）:注射ChR2病毒,表达两周后进行后足切口处理,术后5天进行光刺激操作,n=6;ChR2+DMSO组（ChR2+D）:注射ChR2病毒,表达两周后进行后足切口处理,术后5天注射DMSO 45 min后,进行光刺激操作,n=6;ChR2+哌啶酮组（D2受体拮抗剂组ChR2+D2）:注射ChR2病毒,表达两周后进行后足切口处理,术后5天注射哌啶酮45 min后,进行光刺激操作,n=6。3.光敏病毒转染:用异氟烷麻醉小鼠后,根据小鼠图谱VTA（AP,-3.5 mm,LP,0.5 mm,DP,-3.8 mm）定位注射携带光敏基因ChR2的病毒载体（AAV2/9-EF1α-DIO-ChR2（H134R）-m Cherry）,及其对照（AAV2/9-EF1α-DIO-m Cherry）,分别命名为ChR2组和ChR2对照组。4.病毒表达检测:立体定位注射病毒2周后,进行冰冻切片,在荧光显微镜下检测腹侧被盖区的ChR2病毒表达水平。5.示踪剂检测:立体定位在NAc区注射荧光金（Fluoro Gold,FG）逆行示踪剂,3-5d后灌注取脑,进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察腹侧被盖区荧光金的分布情况。6.术后疼痛模型制备:按Brennan TJ[5]的方法制备趾部切口痛模型,模型组小鼠在异氟烷麻醉后,于左后足跟腱处做一5 mm切口;假手术组除未进行后足切口外,其余处理相同。7.机械性痛阈测定:采用Von frey细丝测定,测试中进行光刺激,观察术前1d,术后1天,3天,5天,7天,10天机械性刺激伤害感受阈的变化。8.免疫荧光检测:Von-frey机械性痛阈测定后,迅速用4%多聚甲醛心脏灌注,取脑组织,进行冰冻切片,免疫荧光检测伏隔核D1,D2受体变化。9.Western bloting检测:Von-frey机械性痛阈测定后,立即取脊髓L3-L5,提蛋白观察脊髓p-PKA表达情况。10.统计学分析:利用SPSS21.0进行统计分析,数据结果采用平均数±标准误（Mean±SEM）表示,统计方法用单因素方差分析或独立样本t检验。P<0.05认为有统计学差异。实验结果1)机械性痛阈测试结果中,模型组小鼠自术后第1天开始,患足机械性刺激伤害感受阈较术前明显降低,与术前基础值和对照组相应时间点相比有显著性差异（***P<0.001）,且这种显著性差异持续到术后5天,第7天时恢复到基础值。ChR2+模型组小鼠在术后5天时,左足机械性刺激伤害感受阈较ChR2对照+模型组明显升高（***P<0.001）。ChR2+哌啶酮组（ChR2+D2受体拮抗剂组）术后第5天开始,左足机械性刺激伤害感受阈较ChR2+DMSO组明显降低,差异具有统计学意义（***P<0.001）。2)荧光金FG逆标神经元在VTA内分布情况表明,腹侧被盖区到伏隔核有纤维投射。3)免疫荧光结果表明,激活腹侧被盖区多巴胺能神经元后,伏隔核多巴胺D1、D2受体激活较‘ChR2对照+模型组’明显增多（**P<0.01）。4)Western blot实验结果表明,激活腹侧被盖区多巴胺能神经元的‘ChR2+模型组’脊髓处磷酸化PKA表达（48.27±4.35）较‘ChR2对照+模型组’（122.3±13.11）显著降低（***P<0.001）,伏隔核注射哌啶酮的D2受体拮抗剂组磷酸化PKA表达（103±5.74）与‘ChR2+模型组’（59.21±5.32）、‘ChR2+DMSO’（58.56±7.15）相比明显增高（**P<0.01）。结论1.兴奋VTA多巴胺能神经元能够缓解术后疼痛、激活NAc D1、D2受体、下调脊髓磷酸化PKA表达,拮抗NAc D2受体可以逆转兴奋VTA多巴胺能神经元对术后疼痛的缓解作用。2.VTA多巴胺能神经元对术后疼痛的抑制作用可能与激活VTA-NAc多巴胺通路,激活NAc DA受体和降低脊髓处磷酸化PKA有关。