多能性干细胞发育潜能的研究

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多能性干细胞,一种具有多分化潜能的细胞,为人类的基础研究提供了良好的细胞模型;尤其它的定向分化能力,为细胞治疗提供了无限应用前景。但是细胞治疗不得不面对另外一个尴尬的问题,如何解决机体免疫系统对异体的排斥?细胞重编程技术的出现使得人们看到了解决免疫排斥的可能性。一个是2002年出现的以体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)为基础的治疗性克隆,另外一个是2006年出现的由外源因子诱导的多能性干细胞(inducedpluripotent stem cells, iPSC)。  在人类临床的应用上,由于核移植重编程效率较低,并且受限于社会伦理以及珍贵稀少的卵母细胞资源,因此一直没有成功的报道。iPSC只需要很少的成体细胞,导入外源因子,持续表达,就可以获得多能性干细胞。资源获取容易,技术简单,便于推广应用,不涉及伦理问题,iPSC为人类的细胞治疗独辟蹊径,开创了细胞重编程的新时代。  经典的iPSC诱导过程,由于外源基因会插入宿主细胞的基因组,很有可能引起突变效应,或者在形成iPSC之后外源基因的持续表达,也会影响它的发育潜能,降低它在应用过程的安全性。缺少致瘤因子c-Myc,利用三个外源因子Oct4,Sox2和Klf4可以诱导体细胞获得iPSC;单独Oct4也可以诱导获得多能性干细胞。这些三因子,单因子的iPSC都相应减少了外源因子的插入,但是他们的发育潜能如何?  在本研究中,首先对不同诱导因子(四因子,三因子,单因子)获得的iPSC发育潜能进行检测。这些细胞系除了多能性标记OCT4,NANOG,SSEA-1检测阳性,进行四倍体胚胎注射,尽管效率有差异,但是都可以获得四倍体补偿动物,从而在体内功能实验证实了这些细胞系(4n-iPSC)的发育多潜能。  此外,我们用不同诱导因子的iPSC作为细胞核供体,进行了核移植。实验结果显示:不同因子iPSC经过核移植重编程,4n-iPSC可以得到克隆动物,与正常ES无差异,但是部分重编程的iPSC,并没有克隆小鼠出生。进一步的实验检测,发现部分重编程的iPSC的12号染色体Dlkl-Dio3母源印记区域基因低表达水平,通过核移植重编程并没有得到完全修复,结果提示相对于细胞核移植,iPSC的重编程过程是一种表观修饰改变更为剧烈的重编程。  最后,为了能够找到一种成份明确的培养基,便于对多能性干细胞发育潜能的研究。我们选用一种对于大鼠和小鼠同样适用的ES培养液——N2B27+2i+lif,进行了小鼠ES的建系以及它发育多潜能的评价。结果显示,在这种成份明确的培养基中,C57近交系可以高效的建立小鼠ES,并且免疫组化染色显示OCT4,NANOG,SSEA-1,AP阳性,此外进行4倍体胚胎注射,可以得到正常健康的胎儿;进一步的实验证实N2B27+2i+lif条件下可以建立孤雄单倍体ES,长期传代过程中,保持基因组的单倍完整性,卵胞质注射可以获得具有普通小鼠发育能力的小鼠,并且维持ES的多能性,体内二倍体嵌合参与生殖细胞发生,提示这种成份明确培养液,适合小鼠ES建系和传代,为下一步研究多能性干细胞的形成和调控机制打下了坚实基础。  综上所述,我们体内体外实验证实了三因子,单因子,四因子的iPSC具有普通ES发育的全能性;iPSC进行核移植,4n-iPS可以得到克隆动物,发现2n-iPSC经过核移植重编程,12号染色体Dlkl-Dio3母源印记区,这一区域的异常表观遗传修饰依然存在;最后我们发现N2B27+2i+lif条件下,可以建立发育多潜能的ES;同时可以建立孤雄单倍体ES,具有小鼠ES的多潜能,可以种系嵌合,并且卵母细胞注射可以获得动物,维持单倍体基因组完整性。
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