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目的:
龋病是人类最常见的一种口腔疾病,而变形链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是引起人类牙齿龋坏的重要病原菌之一。近年来,以木糖醇为代表的多元醇以其能抑制变形链球菌的致龋性而广泛应用于无糖食品中。麦芽糖醇(maltitol)是一种非致龋性的新型糖代用品,但作用机制尚不太明确。本文应用体外实验研究麦芽糖醇对变形链球菌生长、产酸、粘附的影响,并通过电镜观察变形链球菌形态学的改变,探讨其防龋作用机制,从而为麦芽糖醇的防龋特性研究提供更有利的理论依据。
方法:
1、菌液的制备及实验分组:
选择变形链球菌ATCC25175作为实验菌株。将复苏48小时的菌种接种于脑心浸萃(BHI)液体培养基中,37℃条件下厌氧(80% N2、20% CO2)培养24小时,离心,洗菌两次,用PBS缓冲溶液调光密度值(Optical Density,OD)为1.0的菌悬液,备用。
实验分四组:麦芽糖醇组、木糖醇组、阴性对照组(空白组)及阳性对照组(蔗糖组)。
2、麦芽糖醇对变形链球菌生长及产酸作用的影响:
将制备好的菌液分别加入到四组液体培养基中,37℃条件下厌氧(80% N2、20% CO2)培养0h、3h、6h、9h、12h。采用酶标仪测定溶液OD(660nm)值的改变,绘制细菌生长曲线。
采用酸度计将已配制好的四组液体培养基调定初始pH值为7.4,接种变形链球菌菌液,37℃条件下厌氧(80% N2、20% CO2)培养3h、6h、9h、12h,测定上清液的pH值。
3、麦芽糖醇对变形链球菌粘附作用的影响:
将制备好的菌液分别加入到置有四组液体培养基的玻璃试管中,与地面成30°的角度,37℃条件下厌氧(80%N2、20%CO2)培养24小时。将试管中溶液轻轻移去,将粘附到试管壁的细菌用PBS缓冲液洗脱,收集细菌,测定660nm处的光密度(OD)值,并计算粘附抑制率。
4、麦芽糖醇对变形链球菌形态学的影响:
扫描电镜实验:将1.0cm×1.0cm×0.02cm的盖玻片放入15ml试管中随四组液体培养基灭菌备用,分别加入菌液,在37℃条件下厌氧(80%N2、20%CO2)培养24小时,细菌在盖玻片上形成一层生物膜,取出盖玻片,扫描电镜观察。
透射电镜实验:将菌液分别加入四组液体培养基中,在37℃条件下厌氧(80%N2、20%CO2)培养24小时,透射电镜观察细菌细胞结构的变化。
5、统计学分析:
采用SPSS13.0统计软件,各组总体均数之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA);采用Student-Newman-Keuls检验进行各样本组间均数的两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1、麦芽糖醇组、木糖醇组和阴性对照组培养基内细菌的生长受到抑制,从培养3h开始显示OD(660nm)值低于蔗糖组,差异有高度统计学意义(P<0.01),但三组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
蔗糖组从实验开始就迅速产酸,pH值与其余各组相比,差异有高度统计学意义(P<0.01)。从3h时间点开始,木糖醇组的pH值与麦芽糖醇组、阴性对照组相比,差异有高度统计学意义(P<0.01),而其余两个实验组之间则差异无统计学意义(P>0.05)。
2、麦芽糖醇组粘附抑制率最大,其次是木糖醇组,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。阴性对照组的粘附抑制率最小,与前两组相比差异有高度统计学意义(P<0.01)。
3、扫描电镜显示阳性对照组玻片上附有大量细菌,相互粘附,排列密集,构成多层立体结构,细菌胞体形态饱满,保留有链球菌属典型的长链结构;而麦芽糖醇组、木糖醇组和阴性对照组玻片上细菌数量明显减少,粘附明显稀疏,部分区域无粘附,细菌链断裂、分离成短链或单个胞体。
透射电镜显示阳性对照组变形链球菌的细胞壁及细胞膜结构清晰完整,胞浆电子密度表现比较均匀,分裂后的两极细胞形态对称且规则;而麦芽糖醇组、木糖醇组和阴性对照组的变形链球菌的细胞浆电子密度不均匀,细胞壁结构完整性被破坏,甚至出现细胞壁结构的消失,严重部位出现菌体溶解。
结论:
1、麦芽糖醇对变形链球菌的生长具有明显的抑制作用,可显著降低变形链球菌的产酸,抑制其在玻璃表面的粘附。
2、麦芽糖醇可以破坏变形链球菌的超微结构,对其生长及粘附产生抑制作用。