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哺乳动物卵母细胞的生发泡(germinal vesicle, GV)染色质最初是不凝集的,随着卵母细胞生长,染色质会凝集成不同的构型。生发泡染色质构型与卵母细胞发育能力相关。然而,过去报导的卵母细胞生发泡染色质构型分类标准不统一,并且不能很好地与卵母细胞发育能力联系起来。因此,亟需建立卵母细胞染色质构型分类标准,进而明确其与发育能力的关系。此外,玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)可进入食物链引起健康问题,因此研究其对卵母细胞的毒性作用对人类和动物的健康生殖都具有重要意义。体内和体外ZEN暴露都损伤卵母细胞的发育能力,但其作用机理并不清楚。
本研究目的是对卵母细胞染色质构型进行分类,探究ZEN对染色质构型的影响。从GV期染色质构型角度探索其影响卵母细胞质量的潜在机制,深入研究卵母细胞染色质构型与发育能力的关系。首先,本研究利用改进的能够清楚地观察到卵母细胞核仁和染色质的Hoechst33342染色方法,将猪和小鼠GV期卵母细胞按照染色质围绕核仁凝集程度和在核质中的分布情况分为8种构型。然后比较大小卵泡、健康与闭锁、卵巢运输与保存和不同培养基的染色质构型分布确定各构型的发育能力。最后,通过小鼠ZEN体内暴露模型,利用免疫荧光染色、一步法RT-qPCR等方法,探究ZEN对染色质构型和基因转录的影响,进一步了解ZEN损伤卵母细胞的机制。主要的研究结果如下:
1、猪和小鼠卵母细胞染色质构型分类为8种类型:不包围核仁型(NSN)、包围核仁型(SN)、部分NSN(pNSN)和部分SN(pSN)、提前凝集的NSN(cNSN)、pNSN(cpNSN)、pSN(cpSN)、早期终变期(ED)。
2、来源于1-2mm健康卵泡的NSN构型猪卵母细胞在199培养基中经历pNSN、pSN、cpSN到ED的连续转变过程;来源于3-6mm健康卵泡卵母细胞在199培养基中培养时,SN构型卵母细胞染色质发生重新去凝集,形成RDC构型,用Roscovitine抑制GVBD后增加RDC构型的卵母细胞比例。
3、在不利条件下,例如卵泡闭锁、卵巢长时间保存或者在成分简单的MEM培养基中成熟培养,卵母细胞染色质会发生提前凝集,形成cNSN、cpNSN和cpSN构型。
4、所有的NSN和pNSN以及部分pSN和RDC构型卵母细胞进行活跃的基因转录,cNSN、cpNSN和cpSN构型卵母细胞无一表现出转录活动。
5、体外成熟和胚胎培养表明,SN和pSN构型卵母细胞比NSN和pNSN构型卵母细胞发育能力强;cpSN型卵母细胞发育能力强于cNSN和cpNSN构型卵母细胞;只有RDC构型的卵母细胞能发育成囊胚。
6、猪COCs体外成熟期间添加ZEN导致猪卵母细胞NSN构型提前凝集为cNSN构型,卵母细胞的成熟率降低。体内ZEN暴露也降低小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎4-细胞和囊胚比例,表明ZEN通过影响卵母细胞染色质构型影响发育能力。
7、小鼠体内ZEN暴露破坏MI期卵母细胞纺锤体组装,引起MII期卵母细胞染色体非整倍性的比例增加,ZEN通过破坏纺锤体组装影响卵母细胞染色体分离。
8、小鼠体内ZEN暴露升高卵母细胞的H2O2水平,同时降低卵母细胞线粒体膜电位和GSH/GSSG比值。
9、小鼠体内ZEN暴露引起卵母细胞生长过程中NSN、pNSN和pSN构型卵母细胞染色质提前凝集,形成cNSN、cpNSN和cpSN构型。
10、体内ZEN暴露降低卵母细胞整体转录活性,进而导致GV期卵母细胞内与发育能力、纺锤体组装、抗氧化和抗凋亡相关的基因Mater、Oct4、Plk1、Aurka、Cat、Nrf2及Bcl2的mRNA表达显著下调,与氧化还原和促凋亡基因Gpx1、Gsr、Sod2和Bax的mRNA表达显著上调。
总之,我们的研究结果表明,比起以往所报道的分类方法,我们新的染色质构型分类方法更为紧密地将卵母细胞染色质构型与发育能力联系起来。ZEN暴露通过影响染色质构型进而影响基因表达来降低卵母细胞的发育能力。
本研究目的是对卵母细胞染色质构型进行分类,探究ZEN对染色质构型的影响。从GV期染色质构型角度探索其影响卵母细胞质量的潜在机制,深入研究卵母细胞染色质构型与发育能力的关系。首先,本研究利用改进的能够清楚地观察到卵母细胞核仁和染色质的Hoechst33342染色方法,将猪和小鼠GV期卵母细胞按照染色质围绕核仁凝集程度和在核质中的分布情况分为8种构型。然后比较大小卵泡、健康与闭锁、卵巢运输与保存和不同培养基的染色质构型分布确定各构型的发育能力。最后,通过小鼠ZEN体内暴露模型,利用免疫荧光染色、一步法RT-qPCR等方法,探究ZEN对染色质构型和基因转录的影响,进一步了解ZEN损伤卵母细胞的机制。主要的研究结果如下:
1、猪和小鼠卵母细胞染色质构型分类为8种类型:不包围核仁型(NSN)、包围核仁型(SN)、部分NSN(pNSN)和部分SN(pSN)、提前凝集的NSN(cNSN)、pNSN(cpNSN)、pSN(cpSN)、早期终变期(ED)。
2、来源于1-2mm健康卵泡的NSN构型猪卵母细胞在199培养基中经历pNSN、pSN、cpSN到ED的连续转变过程;来源于3-6mm健康卵泡卵母细胞在199培养基中培养时,SN构型卵母细胞染色质发生重新去凝集,形成RDC构型,用Roscovitine抑制GVBD后增加RDC构型的卵母细胞比例。
3、在不利条件下,例如卵泡闭锁、卵巢长时间保存或者在成分简单的MEM培养基中成熟培养,卵母细胞染色质会发生提前凝集,形成cNSN、cpNSN和cpSN构型。
4、所有的NSN和pNSN以及部分pSN和RDC构型卵母细胞进行活跃的基因转录,cNSN、cpNSN和cpSN构型卵母细胞无一表现出转录活动。
5、体外成熟和胚胎培养表明,SN和pSN构型卵母细胞比NSN和pNSN构型卵母细胞发育能力强;cpSN型卵母细胞发育能力强于cNSN和cpNSN构型卵母细胞;只有RDC构型的卵母细胞能发育成囊胚。
6、猪COCs体外成熟期间添加ZEN导致猪卵母细胞NSN构型提前凝集为cNSN构型,卵母细胞的成熟率降低。体内ZEN暴露也降低小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎4-细胞和囊胚比例,表明ZEN通过影响卵母细胞染色质构型影响发育能力。
7、小鼠体内ZEN暴露破坏MI期卵母细胞纺锤体组装,引起MII期卵母细胞染色体非整倍性的比例增加,ZEN通过破坏纺锤体组装影响卵母细胞染色体分离。
8、小鼠体内ZEN暴露升高卵母细胞的H2O2水平,同时降低卵母细胞线粒体膜电位和GSH/GSSG比值。
9、小鼠体内ZEN暴露引起卵母细胞生长过程中NSN、pNSN和pSN构型卵母细胞染色质提前凝集,形成cNSN、cpNSN和cpSN构型。
10、体内ZEN暴露降低卵母细胞整体转录活性,进而导致GV期卵母细胞内与发育能力、纺锤体组装、抗氧化和抗凋亡相关的基因Mater、Oct4、Plk1、Aurka、Cat、Nrf2及Bcl2的mRNA表达显著下调,与氧化还原和促凋亡基因Gpx1、Gsr、Sod2和Bax的mRNA表达显著上调。
总之,我们的研究结果表明,比起以往所报道的分类方法,我们新的染色质构型分类方法更为紧密地将卵母细胞染色质构型与发育能力联系起来。ZEN暴露通过影响染色质构型进而影响基因表达来降低卵母细胞的发育能力。