研究背景多环芳烃（PAHs）是一类持久性有机污染物,广泛分布于空气、水、土壤等环境中。国际癌症研究机构确认PAHs中苯并[α]芘、苯并[α]蒽等化合物具有致癌性。7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）是多环芳烃的一种代表性致癌化合物,已有研究报道DMBA能诱导大鼠乳腺肿瘤。本课题聚焦于DMBA致癌效应的化学预防与其机制的研究。丙戊酸（VPA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）,也是临床上常用的抗癫痫药物。近年发现VPA能抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞分化、促进凋亡,起到抗肿瘤的作用。本课题组先前研究表明:VPA在浓度为200 mg/kg时,对乳腺肿瘤细胞具有抗肿瘤作用;在VPA浓度为50、100 mg/kg时,可以延缓DMBA诱导的肿瘤发生,降低肿瘤形成率,抑制肿瘤生长,同时对正常组织有保护作用,显示VPA对DMBA致癌效应具有化学预防作用。课题组前期研究还发现VPA能引起巨噬细胞在DMBA诱导的乳腺肿瘤组织内浸润,提示VPA可能通过调控免疫细胞的功能发挥其抗肿瘤的预防作用。已有研究表明巨噬细胞的极化状态与其抗肿瘤作用和防御能力密切相关。巨噬细胞极化包括经典活化的M1型和代替活化的M2型巨噬细胞。通常情况下,巨噬细胞在干扰素-γ（IFN-γ）、脂多糖等因子作用下,可以极化为M1型巨噬细胞,其表面标志物为CD86,且可以分泌一些促炎因子白介素12（IL-12）,肿瘤坏死因子α（TNF-α）等杀伤肿瘤细胞,具有抗肿瘤的作用。同时巨噬细胞可以在白介素-4（IL-4）等因子的作用下,极化为M2型巨噬细胞,其表面标志物为CD163,且可以分泌一些抗炎因子转化生长因子-β（TGF-β）,白介素10（IL-10）等促进血管生成和肿瘤细胞生长。有研究表明,具有HDACi作用的TMP195可诱导肿瘤内高吞噬和刺激性巨噬细胞的招募和分化。但是,VPA能否通过调控巨噬细胞的极化状态预防多环芳烃化合物的致癌性目前尚不清楚。综上,本课题在前期研究基础上,将进一步探讨VPA是否通过调控巨噬细胞的极化状态预防DMBA所诱导的大鼠乳腺肿瘤的发生以及防护正常组织的作用,旨在为环境致癌物致癌效应的化学预防提供科学实验依据和全新思路。研究方法1.VPA预防DMBA致乳腺肿瘤动物实验设计与分组课题组前期已经成功建立VPA预防DMBA致乳腺肿瘤的动物模型。模型建立简述如下:取50日龄雌性SD大鼠随机分为非DMBA处理组（非DMBA组）以及DMBA诱导肿瘤组（DMBA组）,每组又进一步分为对照组、VPA 50 mg/kg和VPA 100 mg/kg处理组。将DMBA溶解于玉米油中,浓度为20 mg/mL,单次1 mL对DMBA组的大鼠进行灌胃,非DMBA组则单次1mL玉米油灌胃。从灌胃后的第15天,各组动物相应的每天腹腔注射单纯溶剂、VPA 50 mg/kg或者VPA 100 mg/kg,连续注射至第120天,第125天处死大鼠实验结束。在处死大鼠前的24 h,腹腔注射BrdU,观察细胞掺入BrdU的能力。实验结束后,通过分析肿瘤大小研究VPA对DMBA诱导的肿瘤发生与生长的影响,这部分内容已在前期研究工作中完成,本课题主要完成以下实验检测。关于本课题VPA剂量的选择,由于课题组前期在动物实验中选用了相当于临床治疗癫痫病剂量200 mg/kg用于肿瘤相关治疗研究,所以在本研究动物实验中,选用了低于治疗剂量的50和100 mg/kg用于预防肿瘤发生发展的研究;同时,依据50和100 mg/kg的动物实验剂量推算出细胞水平使用的VPA剂量为0.2和0.4 mM。2.组织形态结构、细胞凋亡和血管生成的检测通过HE染色观察非DMBA组以及DMBA组的病理形态学变化,通过免疫组织化学法（IHC）和蛋白印迹实验（Western blotting）检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3以研究细胞凋亡情况,通过免疫荧光染色检测血管内皮细胞表面标记物CD31以研究组织血管生长情况。3.巨噬细胞表型以及相关炎性因子的检测①巨噬细胞的鉴定:通过IHC检测巨噬细胞的表面标志物F4/80、CD68的表达,免疫荧光共定位法检测髓系巨噬细胞标志物F4/80和CD11b的表达;②巨噬细胞极化状态的鉴定:通过RT-qPCR检测M1（CD86）/M2（CD163）型巨噬细胞的表面标志物与功能标志物（诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/精氨酸酶-1（Arg-1））以及相关的因子（IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10 和 TGF-β）的表达。4.巨噬细胞的吞噬、杀伤肿瘤细胞能力的检测通过免疫荧光共定位染色F4/80和肿瘤细胞标志物（EpCAM）检测巨噬细胞的吞噬能力,通过IHC和Western blotting检测CD8+T细胞、颗粒酶-B（Granzyme-B）的表达。5.正常器官组织内巨噬细胞表型以及相关炎性因子的检测各组正常器官组织中的脾脏和小肠组织的检测:①脾和小肠增殖能力的检测:通过BrdU的IHC检测组织中表达BrdU细胞的数量。②巨噬细胞的鉴定:通过IHC检测巨噬细胞的表面标志物CD68表达;③巨噬细胞极化状态的鉴定:通过RT-qPCR检测标志物 CD86/CD163 以及相关的因子（IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-10 和 TGF-β）的表达。6.在细胞水平上,检测巨噬细胞极化对血管内皮细胞生长的影响首先用培养了正常细胞MCF10A和恶性转化细胞MCF10A-DMBA的条件培养基分别作用于巨噬细胞,以分别模拟肿瘤组织或正常组织的生存环境,然后用巨噬细胞裂解液作用于血管内皮细胞HUVEC,以研究VPA调节巨噬细胞极化对血管内皮细胞生长的影响。通过RT-qPCR检测标志物CD86/CD163以及相关的因子（IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-10）的表达。MTT实验检测HUVEC细胞生长情况。统计分析所有实验数据以平均值±标准差（X±S）表示,数据采用SPSS软件上Student’s t检验进行分析。P值表示为:*代表P＜0.05或**代表P＜0.01,认为差异具有统计学意义。研究结果1.VPA促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤组织间血管生成在动物水平上,通过HE染色,观察到非DMBA组,乳腺组织中有少量导管和大量疏松结缔组织,单独使用VPA组与对照组无明显差异。在DMBA组有大量恶性细胞,乳腺导管病理性增生和间质纤维化,VPA干预后的DMBA组,出现空泡状等组织损伤表现。IHC和Western blotting结果显示,Cleaved Caspase-3表达在非DMBA组加入VPA后无明显差异,但在DMBA组VPA干预后,Cleaved Caspase-3表达显著增加（P＜0.01）,提示VPA促进了 DMBA所诱导的乳腺肿瘤细胞凋亡。通过IHC对血管内皮细胞标志物CD31进行染色,结果显示在DMBA组,VPA干预后,血管密度明显减少（P＜0.01）,还提示VPA能抑制肿瘤组织间血管的生长。2.VPA促进肿瘤组织内巨噬细胞的浸润,并影响其极化状态IHC实验表明,在DMBA组,VPA干预后,肿瘤组织内表达F4/80及CD68细胞数量明显增加（P＜0.05）,说明VPA促进巨噬细胞在肿瘤组织内浸润。IHC实验表明,髓系细胞的标志物CD11b,在DMBA组加入VPA后,表达明显增加（P＜0.05）,免疫荧光实验表明,CD11b和F4/80表达共定位在同一细胞中,说明巨噬细胞可能是髓系来源的。RT-qPCR结果表明,在DMBA组,VPA干预后,M1与M2型巨噬细胞表面标志物（CD86/CD163）的比值明显升高（P＜0.01）,功能标志物（iNOS/Arg-1）的比值在VPA浓度为100 mg/kg时明显升高（P＜0.05）,M1型分泌的促炎因子（IFN-γ、IL-12和TNF-α）表达明显增加（P＜0.01）,M2型分泌的抗炎因子（IL-4、IL-10和TGF-β）表达明显降低（P＜0.05）,说明在肿瘤组织内,VPA干预后使巨噬细胞向M1型极化。在非DMBA组,VPA则使CD86以及相应的促炎因子（IFN-γ、IL-12和TNF-α）表达明显降低（P＜0.05）,而CD163以及相关的抗炎因子（IL-10和TGF-β）表达明显升高（P＜0.05）,说明在非DMBA处理组,VPA使正常乳腺组织内的巨噬细胞向M2型极化。3.VPA诱导肿瘤组织内浸润的巨噬细胞具有吞噬能力,同时促进活化的CD8+T细胞在肿瘤组织内浸润免疫荧光实验表明,在DMBA组,VPA干预后,EpCAM和F4/80表达共定位在同一细胞中,提示巨噬细胞具有吞噬肿瘤细胞的能力,也说明VPA诱导的巨噬细胞具有较强的吞噬能力。IHC实验表明,在DMBA组,VPA干预后,CD8+T细胞数量明显增多（P＜0.01）。对CD8+T细胞的功能标志物Granzyme-B表达通过IHC和Western blotting实验检测,结果均表明,在DMBA组加入VPA后,Granzyme-B表达明显增加（P＜0.05）,结果表明在DMBA诱导的乳腺肿瘤发生过程中,VPA能激活CD8+T细胞介导的免疫反应。4.VPA在预防肿瘤发生时,对正常组织器官的保护作用我们选择脾和小肠以观察VPA对正常组织器官的影响。IHC实验表明,DMBA组的脾和小肠中表达BrdU增殖标志物的细胞数量有所下降,但加入VPA后,脾和小肠的增殖细胞数量明显上升（P＜0.01）。说明VPA恢复了脾和小肠组织细胞的增殖能力,对正常组织具有保护作用。IHC实验表明,在DMBA组,加入VPA后,脾和小肠中表达CD68的细胞数量明显减少（P＜0.01）,提示正常组织的保护作用可能与减少巨噬细胞的浸润有关。RT-qPCR结果表明,在DMBA组的脾组织内,VPA使CD86和相关促炎因子IFN-γ表达明显下降（P＜0.01）。在DMBA组的小肠组织内,VPA也使M1型的相关促炎因子IFN-γ、TNF-α表达明显下降（P＜0.01）,而CD163和相关的抗炎因子IL-10和TGF-β表达明显上升（P＜0.05）。在非DMBA组的脾和小肠内,加入VPA之后,相关因子的表达并无差异（P＞0.05）。表明VPA在预防肿瘤发生的同时,还能通过调控巨噬细胞向M2型极化实现对正常组织的保护作用,显示VPA对肿瘤组织和正常组织的双向调控作用。5.VPA能通过调节巨噬细胞的极化影响血管内皮细胞的生长首先用培养过MCF10A-DMBA恶性转化肿瘤细胞的条件培养基处理巨噬细胞RAW264.7,以模拟肿瘤组织中巨噬细胞的生存环境。RT-qPCR结果表明,CD86/CD163表达的比值在加入VPA后升高（P＜0.01）,同时M1型巨噬细胞分泌的相关炎性因子TNF-α、IL-12和IFN-y表达增加（P＜0.05）,提示在此环境中VPA可诱导巨噬细胞向M1型极化;进一步用VPA所诱导的M1型巨噬细胞的裂解液作用HUVEC细胞,可抑制HUVEC细胞的生长。用培养过正常细胞MCF10A的条件培养基处理RAW264.7,以模拟正常组织中巨噬细胞的生存环境,发现0.4 mM VPA使CD86/CD163比值降低,M1型巨噬细胞分泌的相关炎性因子TNF-α、IL-12和IFN-y表达减少（P＜0.05）,M2型巨噬细胞分泌的相关因子IL-10表达增加（P＜0.01）,提示在此环境中VPA可诱导巨噬细胞向M2型极化,进一步用VPA所诱导的M2型巨噬细胞的裂解液作用HUVEC细胞,则可促进HUVEC细胞的生长。结果表明,在模拟肿瘤细胞生存的条件下,VPA使巨噬细胞向M1型极化并能抑制HUVEC细胞的生长;然而在模拟正常细胞的生存条件下,VPA使巨噬细胞向M2型极化则能促进HUVEC细胞的生长。研究结论1.在多环芳烃化合物DMBA诱发乳腺肿瘤发生过程中,VPA能通过激活巨噬细胞向M1型极化介导促炎反应,促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤组织间血管的生成,达到预防肿瘤发生和发展的作用;同时VPA还能通过激活巨噬细胞向M2型极化介导抗炎反应,对正常组织起到一定的保护作用。2.在细胞水平上,通过模拟肿瘤细胞和正常细胞的生存环境,进一步证明VPA能直接调节巨噬细胞极化以影响血管内皮细胞的生长。