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目的本实验旨在研究角膜上皮细胞是否有AMPK磷酸化表达,以及真菌对角膜上皮细胞AMPK磷酸化的影响,并探讨AMPK磷酸化与炎症因子IL-6的关系,以探究真菌性角膜炎的发病机制,为开发新型抗感染药物提供新的思路。方法1.分别给予AMPK激动剂AICAR、AMPK抑制剂Compound C与角膜上皮细胞共孵育,设置AICAR的浓度梯度:0μM、100μM、300μM、500μM、1000μM,设置 Compound C 的浓度梯度:0μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM,培养至细胞生长平台期,用实时无标记细胞多功能分析仪观察药物对细胞生长的影响,确定药物使用的安全浓度。2.给予AICAR刺激角膜上皮细胞,设置AICAR浓度梯度:0μM、50μM、500μM、1000μM,培养4h,提取细胞蛋白;设置AICAR刺激的时间梯度:0h、1h、2h、4h,提取细胞蛋白,Western Blot检测AICAR对角膜上皮细胞AMPK磷酸化的影响,以确定最佳药物浓度和最佳作用时间。3.实验分为单纯角膜上皮细胞组(Cell,C)(C)组、角膜上皮细胞(Cell,C)+孢子(Spore,S)(C+S)组、角膜上皮细胞(Cell,C)+孢子(Spore,S)+AICAR(A)(C+S+A)组、角膜上皮细胞(Cell,C)+孢子(Spore,S)+Compound C(CC)(C+S+CC)组,Western Blot检测真菌孢子对角膜上皮细胞中AMPK、p-AMPK的表达,ELISA法测定角膜上皮细胞培养上清液中IL-6的表达。结果1.于 24h、36h、48h 时,AICAR 100μM 组、300μM 组、500μM 组、1000μM组细胞指数与对照组比较均无统计学意义(P>0.05);48h之后角膜上皮细胞的生长进入平台期,于60h、72h时,AICAR 100μM组、300μM组、500μM组、1000μM组细胞指数与对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。2.于 24h、36h、48h、60h、72h 时,Compound C 10μM 组、12.5μM 组细胞指数与对照组比较均无统计学意义(P>0.05);于24h时,Compound C 15μM组与对照组比较均无统计学意义(P>0.05),于36h、48h、60h、72h时,Compound C 15μM组细胞指数与对照组比较均有统计学意义(P<0.05),48h后角膜上皮细胞生长进入平台期;于 24h、36h、48h、60h、72h 时,Compound C 17.5μM 组、20μM组细胞指数与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。3.与对照组相比,AICAR 50μM组、500μM组、1000μM组AMPK磷酸化水平均有统计学意义(P<0.05),在所选浓度范围内,AICAR 1000μM组AMPK磷酸化水平最高。4.与对照组比较,1h、2h时AMPK磷酸化水平均无统计学意义(P>0.05),4h时AMPK磷酸化水平有统计学意义(P<0.05)。5.与C组比较,C+S组AMPK磷酸化水平有统计学意义(P<0.01);与C+S组比较,C+S+A组、C+S+CC组AMPK磷酸化水平均有统计学意义(P<0.05)。6.与C组比较,C+S组IL-6表达有统计学意义(P<0.01);与C+S组比较,C+S+A组IL-6表达量无统计学意义(P>0.05),但有增高的趋势,C+S+CC组IL-6表达量有统计学意义(P<0.05)。结论角膜上皮细胞中有AMPK磷酸化表达,且真菌孢子刺激角膜上皮细胞后AMPK磷酸化增强,前炎症因子IL-6分泌增多,AMPK磷酸化与IL-6可能存在于同一信号通路,共同参与真菌性角膜炎的致病过程。