研究目的:探究弥可保对缺氧状态下神经干细胞存活、增殖、凋亡、分化的影响,并探讨其作用机制,以找到一种新生儿缺血缺氧性脑病的治疗或辅助治疗药物。研究方法:利用原代神经干细胞,对其进行缺氧处理,缺氧条件为90%N2,5%C02,5%空气。通过MTT法检测药物对于神经干细胞活性的影响,并探究在缺氧状态下弥可保对于神经干细胞活性是否具有挽救作用。通过EdU试剂染色,在荧光显微镜下观察神经干细胞在缺氧时增殖能力的变化,同时利用实时定量qPCR检测干性基因Sox2的mRNA在处理前后变化的水平,在蛋白分子水平上利用蛋白印记法观察干性基因Sox2在处理前后的水平的变化。通过免疫荧光进行cleaved-caspase3的染色,检测凋亡比率变化。神经干细胞本身具有独特的干细胞特性,然而对于中枢神经系统来说,神经干细胞的主要功能是维持自身数量的稳定以及保持神经元与星形胶质细胞数目的稳态,通过利用免疫荧光标记神经元的标记与星形胶质细胞的标记,以确定这两种成熟细胞在细胞总数中比率的变化情况,蛋白印记法检测Tuj1与GFAP在蛋白水平的变化以确认现象,同时运用实时定量PCR检测其Tuj1上游包括ngn1,NeuroD1,MAP2以及GFAP的mRNA表达情况。对于机制的研究主要集中在表观遗传上。因弥可保参与甲硫氨酸循环,促进甲基转移,而表观遗传的变化如组蛋白的甲基化同神经干细胞命运息息相关,尤其是H3K4与H3K27发生的甲基化。所以我们通过蛋白印记法检测H3K4与H3K27的三甲基化在分子水平的变化。文献报道ERK信号通路与H3K4的三甲基化关系密切,通过蛋白印记法检测磷酸化的ERK在蛋白分子水平的变化程度来诠释组蛋白的甲基化的变化情况尤其是H3K4的甲基化情况。按照实验需求,对实验的分组如下,主要包括空白对照组、弥可保处理组、缺氧组、缺氧及弥可保处理组四组。研究结果:通过MTT法以探究不同浓度的弥可保对神经干细胞活性的影响,经过浓度梯度实验发现弥可保对于神经干细胞的活性有一定程度的促进作用,最终发现0.01μM与0.1μM的弥可保对于神经干细胞而言,对其活性影响无统计学差异(P>0.05),而11μM与10μM的弥可保对于神经干细胞而言,对增强其活性影响有统计学差异(P≤0.05)。进一步利用最低有效浓度即1μM的弥可保探究其对缺氧状态下的神经干细胞的活性的影响发现,在缺氧状态下,神经干细胞的活性降低,而在弥可保作用后,神经干细胞的活性显著性提升。弥可保对于缺氧状态下神经干细胞增殖能力的变化研究表明,在缺氧状态下,弥可保可以挽救神经干细胞增殖能力下降的情况,从而对正常或缺氧状态下神经干细胞的增殖能力起到明显的促进的作用。而对于凋亡的变化,通过免疫荧光计数观察到凋亡的(cleaved-caspase3阳性的)细胞在缺氧状态下明显增加,而在弥可保作用后,凋亡的细胞数目显著性降低,表明其抑制了细胞的凋亡。进一步研究弥可保对神经干细胞分化能力的变化,同样通过免疫荧光计数我们发现神经干细胞在弥可保的干预作用下,可以明显的弥补因为缺氧造成的神经干细胞向神经元与星形胶质细胞分化不足的现象,同时在mRNA与蛋白水平印证了这一点。H3K4me3与H3K27me3在发育过程中,对于神经干细胞的命运中起着决定作用。通过蛋白印记检测发现,在缺氧的环境中,H3K4的三甲基化出现了显著的下降,而相对于H3K27来说,它的三甲基化未出现显著性变化。而在弥可保作用24小时后,H3K4me3的水平上升,H3K27me3变化依旧不大。ERK信号通路在募集H3K4甲基化介质中扮演十分重要的角色,通过蛋白印记检测发现,在缺氧状态下神经干细胞中ERK信号通路的磷酸化水平是下降的,而在弥可保作用24小时后,ERK的磷酸化水平上调。研究结论:在缺氧状态下,弥可保可以保护神经干细胞的活性,能挽救缺氧状态下神经干细胞的增殖能力,并且促进神经干细胞向神经元与星形胶质细胞的分化,抑制其在缺氧状态下的凋亡,对于新生儿缺血缺氧性脑病可能具有治疗或辅助治疗的作用。