R环,一种由DNA-RNA形成的杂合链和一条游离状态的单链DNA共同组成的三链结构。形成R环的因素有很多种,由于转录过程中缺少DNA-RNA的解旋酶或者转录形成的RNA没有被及时的加工,都会导致R环的产生。早期研究发现R环的产生会导致DNA损伤积累和基因组稳定性下降,并且在一些癌症的相关研究中发现许多与R环相关的基因都存在异常表达。随着对R环的探索不断深入,研究发现R环在正常生物体内普遍存在,不仅是在高等动物,在酵母、大肠杆菌中也发现R环的存在。目前研究认为虽然R环在癌症的发生发展具有一定的促进作用,但是一些正常的生理活动也离不开R环的调节。R环与一些疾病之间的联系并不像癌症基因与疾病那么明显,R环促进疾病与癌症发生的原因主要是R环的特殊结构间接导致。R环的特殊结构会引起DNA双链断裂(DSB)、基因重组,并且在转录过程中R环还会介导转录的不正常延长。研究发现,在转录过程中形成R环之后,为了维持转录与DNA复制的正常进行,XPF和XPG两种核酸内切酶会将R环从DNA双链上切除下来,这就导致DNA双链断裂。同时,如果转录过程中形成的R环没有被正确的切除或者降解,将会增加后续DNA复制压力,并造成复制叉失速。而失速的复制叉和R环一样是一种非常不稳定的结构,容易导致基因重组,降低基因组的稳定性。在转录过程中,WAC将RNF20/40与RNAPⅡ缔合在一起,通过增强RNF20/40的E3连接酶活性促进H2B泛素化从而调节转录过程。研究发现,在Bre1(RNF20/40)缺失的哺乳动物中,染色体不稳定(CIN)急剧增加。而CIN被认为是癌症发生的早期事件,并且DSB是造成CIN的关键原因。同时近几年研究发现许多的RNA结合蛋白(RBP)在转录到翻译过程会影响基因组稳定性,例如:加帽酶、SRSF1、SETX。RBP能够抵消转录过程形成的负超螺旋,从而抑制R环的产生。本研究中,我们发现RNF20、WAC与SC35(SRSF2)通过调节转录的某些过程,从而抑制R环的产生。通过免疫荧光染色,我们发现在U2OS细胞核内WAC与SC35存在非常明显的相互作用。同时,通过免疫沉淀和免疫印迹,在293T细胞中也证明内源性的WAC与SC35存在相互作用。为了探究WAC和SC35对R环产生的具体影响,我们用siRNA处理U2OS细胞来调节特定蛋白的表达。同时,用特异性识别R环中DNA-RNA结构的抗体对R环染色,对不同实验组中细胞核内R环的数量进行量化。SETX作为一种DNA-RNA的解旋酶,在转录过程中能够将DNA与RNA分离。目前已知在敲低SETX蛋白表达之后,细胞内的R环数量会有明显的上升。因此我们用SETX作为相应的阳性对照,来验证在U2OS中S9.6的染色结果。结果表明,经过siRNA处理的细胞其细胞核内R环的数量有明显的上升,并且伴随着γH2AX形成,这标志着DNA的损伤的增加。为了进一步验证S9.6染色结果的正确性,我们构建了HA-RNH1(HARNASEH1)质粒。RNH1作为一种核糖核酸酶,能够催化RNA水解。在R环形成之后,过量表达的RNH1能够将DNA-RNA中的RNA部分降解,使得S9.6抗体无法识别单链DNA结构。我们在用siRNA处理U2OS的同时瞬转HA-RNH1质粒,通过免疫荧光观察细胞核内R环数量的变化。结果表明,在过表达RNH1之后,在U2OS细胞核内能够被S9.6抗体识别的R环数量急剧降低。在确认RNF20、WAC、SC35与R环之间的联系之后,我们也验证了R环与DNA损伤的联系。在敲低了RNF20、WAC与SC35蛋白表达之后,我们发现U2OS细胞内γH2AX的数量有明显的上升。同时,在我们用DOX(Doxorubicin,盐酸阿霉素)进一步处理之后,U2OS细胞核内γH2AX的数量有更加明显的上升。在发现WAC与SC35存在相互作用,并且在WAC与SC35低表达时细胞内R环的数量有明显的上升之后。为了进一步探究WAC与SC35在转录过程中影响R环产生的位点的,我们用siRNA处理293T细胞,并且进行DRIP-qPCR实验。实验结果表明,在WAC与SC35蛋白低表达时,二者转录过程形成R环的位点有非常大的重合。并且在相关的ChIP-seq实验中,我们发现WAC与SC35的富集区域也有很大的重合。