一、研究背景帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是一种较为常见的中老年人神经系统退行性疾病,主要表现为肢体运动性障碍。现有研究认为,PD的主要病变部位在中脑黑质以及纹状体区域,也有在苍白球、壳核、尾状核、丘脑底核、三脑室及大脑皮质等处,病理上常表现为严重的中脑黑质部多巴胺能神经元丧失。对于其发病机制目前仍未明了。现有研究表明PD仍是一种无法治愈性疾病,然而,治疗可以明显改善患者的生活质量。目前临床上针对这种疾病主要有两种治疗手段,其一是药物治疗,这种方法是早期患者的首选治疗手段,通过合理的药物搭配及调整用量,多数患者在起病5年内症状能够得到有效控制,然而,随着疾病的进展,治疗将逐渐失效。其二是手术治疗,20世纪初,主要的手术方式为核团毁损术,对于一些以肢体震颤表现为主的患者治疗效果较好,然而,手术后并发症较多。因而逐渐被脑深部电极刺激术(DBS)所取代。回顾性研究表明DBS手术疗效至少在两年内是稳定的,而且术后患者口服药物用量减少。然而,存在这样一个问题：药物治疗和手术治疗皆不能延缓疾病的进展。随着再生医学的发展,研究人员开始探索通过细胞移植来延缓或抑制中脑黑质部多巴胺能神经元的凋亡,从而恢复神经环路中多巴胺递质的水平治疗PD。干细胞作为一类可以在体内和体外大量自我复制、并能够持续保持不对称分裂特性的细胞群,主要包括胚胎干细胞及成体干细胞。在干细胞移植治疗PD的实验中,各种干细胞均收到良好的治疗效果。其中,间充质干细胞(MSCs)作为一种成体干细胞,由于其来源丰富,易获取,已成为一种理想的种子细胞。已有研究表明间充质干细胞移植治疗PD确实能改善PD的症状。然而,其作用机制目前仍未完全明了。既往研究认为,MSCs的作用机制主要在两个方面：其一,MSCs具有多向分化能力,在脑内能够定向分化多巴胺能神经元,替代受损的神经元；其二,MSCs能够分泌各种神经营养因子(如：GDNF、NGF),改善残存神经元局部微环境,抑制多巴胺能神经元凋亡。近年来,越来越多的证据表明神经炎症反应是帕金森病发病的一个重要机制,而且小胶质细胞作为脑内主要的固有免疫细胞在这一过程中具有重要的作用。活化的小胶质细胞能够分泌多种炎性因子(如：TNF-α、IL-1β)促使多巴胺能神经元的凋亡。此外,大量研究发现MSCs不仅具有较强的增殖及多向分化功能,而且具有免疫调节特性。这一点在一些免疫相关性疾病的研究中已经得到充分证实。由美国国家健康中心资助的临床试验网报道称,MSCs作为免疫调节剂的治疗价值目前已经在一些Ⅰ期,Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中进行探究,其中许多试验最近已经完成或正在进行中。由于其免疫抑制特性,研究者认为MSCs在维持外周耐受和诱导移植耐受方面具有重要的作用,并且认为MSCs是细胞移植治疗GVHD、自身免疫性疾病和预防实体器官移植后排斥反应的理想选择。因而我们假设这样一个事实：间充质干细胞能否通过免疫调节特性抑制PD患者脑内炎性细胞的活性,从而抑制多巴胺能神经元的凋亡。本课题组前期体外研究发现,人胎盘底蜕膜间充质干细胞(hPDB-MSCs)具有和骨髓来源的MSCs相似的形态学、免疫表型和功能特点。而且目前尚无hPDB-MSCs移植治疗PD模型大鼠方面的研究。因而,本实验拟通过将hPDB-MSCs静脉移植入PD模型大鼠体内,探讨其对PD模型大鼠的影响并探讨其能否通过抗炎机制改善PD大鼠症状。二、本研究的目的本研究的目的在于验证本课题组前期体外分离培养并纯化的人胎盘底蜕膜间充质干细胞(hPDB-MSCs)与其他间充质干细胞一样,同样能够发挥抗炎特性,同时探讨hPDB-MSCs移植入PD模型大鼠体内能否抑制PD模型大鼠脑内炎性细胞的活化以及一些炎性因子的分泌,从而抑制PD模型大鼠中脑黑质部位多巴胺能神经元的凋亡,改善PD模型大鼠的症状。三、研究方法1.hPDB-MSCs的复苏及体外培养：将冻存的hPDB-MSCs细胞移入37℃温水中进行快速解冻并移入离心管,加入10倍体积的DMEM/F12培养基后将其置入离心机中1000rpm离心5min。去除上清液后用含10%FBS的DMEM/F12培养基重悬,按1×106/L的密度接种于25T培养瓶中,置入37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,次日进行换液,待细胞融合达到80%左右用0.25%胰蛋白酶消化,按1：2传代,并定期在显微镜下观察细胞形态。传代3次后留取对数生长期细胞备用。2.PD模型大鼠的建立：术前给予腹腔注射阿朴吗啡(APO:0.5mg/kg)淘汰出有旋转行为的大鼠。在大鼠脑立体定向仪的引导下通过向大鼠脑右侧中脑黑质致密部以及腹侧被盖核团位置注入6-OHDA药物来诱导建立PD模型大鼠。注药靶点主要是根据paxinos编著的《大鼠脑立体定向图谱》来确定,注药后通过APO诱导旋转实验来评价模型是否成功。成功模型的评价标准为注药10分钟后开始计数半小时内大鼠恒定向左旋转的圈数,一周一次,连续3周,若恒定向左平均旋转圈数>7r/min,则视为成功PD大鼠模型。3.分组及处理：将成功模型并随机分为模型组与移植组。将用PBS重悬的hPDB-MSCs尾静脉移植入移植组大鼠中,同时向模型组大鼠注入等量体积的PBS。4.行为学检测：对比观察各组不同时间点(移植后3d、1周、2周及4周)的行为学改变。5.免疫组化检测各组损伤侧TH及Iba1的表达：将各时间点脑组织标本进行石蜡包埋固定后进行切片,按照SP免疫组化试剂盒说明书行TH及Iba1免疫组织化学染色。主要检测移植后3天、1周、2周及4周各组大鼠损伤侧黑质TH、Iba1表达。具体步骤如下：室温下3%双氧水孵育10min后PBS冲洗3min×3次；正常山羊血清封闭液封闭15min后不冲洗;每张切片滴加50μl一抗,阴性对照组切片滴加等体积PBS,置入4℃冰箱中孵育过夜,PBS冲洗3min×3次；每张切片滴加50μl生物素化二抗(羊抗小鼠IgG),室温下孵育15min后用PBS冲洗3min×3次；滴加50μl辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,室温孵育15min, PBS冲洗3min×3次；DAB显色,显微镜下控制反应时间,及时用蒸馏水终止反应；切片复染、脱水透明后用中性树脂封片,显微镜下观察结果并拍照。每只大鼠每个指标选取5张切片,在高倍镜(×400)下同一背景下选取5个不同视野进行细胞计数,分别计数损伤侧与健侧TH、Iba1阳性细胞数,并计算出损伤侧与健侧阳性细胞百分比进行统计分析。6.Q-PCR检测抗炎因子hIL10、hTGF-β及炎性因子TNF-α表达：各组大鼠麻醉后在冰面上快速断头取脑,切取前囟后4.4mm-7mm层面右侧中脑黑质部位脑组织,约黄豆大小。按照RNA提取纯化试剂盒说明书进行提取总RNA。取5μg总RNA作为模板按反转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。按PCR试剂盒说明书方法,采用20μl反应体系。PCR反应条件为：预变性95℃2min,变性95℃10s,退火60℃30s,延伸70℃30S,共进行40个循环。运用2-ΔΔCt法,得出其余各时间点移植组与模型组3d时间点表达量的倍数关系进行统计。7.数据统计：数据用平均数±标准差表示,并采用SPSS13.0软件进行数据分析。四、结果1.hPDB-MSCs形态：hPDB-MSCs在形态上与其他来源的MSCs基本一致,皆呈梭形成纤维细胞样,旋涡状生长。2.PD建模：建模成功率56.5%,PD模型大鼠常表现出竖毛、躬身、少动、行动迟缓等现象。3. hPDB-MSCs移植后1周、2周、4周,在APO诱导的旋转实验中发现,各时间点移植组大鼠APO诱导的平均旋转圈数均低于模型组(P<0.05)。脑组织切片免疫组化结果显示：移植组损伤侧黑质部位移植后4周TH阳性细胞数较移植后3d时明显增加(P<0.01)。与相应时间点模型组相比,移植术后2周、4周移植组TH阳性细胞明显增多(P<0.05),移植术后4周移植组黑质部位活化小胶质细胞减少。在mRNA水平,移植组hIL10及hTGF-β表达均较模型组增加,以移植后1周与2周时明显(P<0.05),而TNF-α表达量则逐渐降低。五、结论本研究发现hPDB-MSCs作为一种新的间充质干细胞来源,将其静脉移植入PD模型大鼠体内同样能够延缓多巴胺能神经元的凋亡,改善PD模型大鼠的症状。此外,本研究表明抗炎特性是hPDB-MSCs发挥神经保护作用的一个重要机制。hPDB-MSCs能够通过调控一些抗炎因子分泌抑制小胶质细胞活化及炎性因子的分泌发挥抗炎作用从而达到神经保护作用。