木质纤维素生产燃料乙醇是获取可再生能源的有效手段之一,而纤维素酶在这个过程中扮演着非常重要的角色,生物能源的启动带来了纤维素酶研究的第二次浪潮。在众多的纤维素酶生产菌中,木霉属是被关注和研究得最多的菌株,其中尤以里氏木霉为甚。然而,木霉菌纤维素酶的研究还存在一些关键问题值得探讨,包括新酶的寻找、木质纤维素酶解过程中所需的最适用酶量和酶复配组合、以及β-葡萄糖苷酶为何是木霉菌纤维素酶系的限制性成分等。针对这些问题,本论文从另一个木霉菌株-绿色木霉着手,从三个方面展开了研究,即酶系中主要组分的鉴定、纯化和酶学性质；酶组分的复配优化与在酶解汽爆玉米秸秆上的应用以及就酶系中的限制性组分β-葡萄糖苷酶,从合成与分泌的角度探讨了它在菌丝中的定位与分布。 首先研究了摇瓶水平上绿色木霉合适的发酵条件,确立了以微晶纤维素为碳源、硫酸铵为氮源、温度28℃、转速150rpm的培养条件。培养120h后发酵液中总蛋白量为1.4mg/mL,滤纸酶活为8.3 FPA/mL。通过对发酵液上清进行SDS-PAGE和胶内活性染色,初步判断了酶系中存在三种内切酶组分和三种外切酶组分；随后在2-D电泳上获得了该酶系的全蛋白图谱,就其中主要的蛋白点进行了高效液相色谱-离子阱-质谱(HPLC-ESI-MS)分析,鉴定出九种蛋白,包括七种纤维素酶和一种几丁质酶以及一种α-淀粉酶；其中纤维素酶组分包括三种内切酶Ce17B(EGI),Ce112A(EG III),Ce161A(EGIV);三种外切酶Ce17A(CBH I),Ce16A(CBH I),Ce16B(CBH IIb)和一种β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。随后应用离子色谱、疏水色谱以及凝胶色谱等对纤维素酶组分进行了纯化,获得了电泳纯的样品。纯度经HPLC检测均达到90％以上。酶学性质分析表明,外切酶组分的最佳pH为5.0,最佳温度在40-50℃之间；内切酶组分最佳pH在4.5左右,最佳温度在45-50℃之间。β-葡萄糖苷酶的最佳pH为5.0,温度在40-55℃之间能维持较好的活力,以pNPG为底物时,该酶的米氏常数和最大反应速率分别为Km=3.83 μmol/mg,Vmax=7.03 μmol/min/mg。所有单酶组分都体现酸性蛋白性质,等电点在4.0-6.5范围。金属离子和表面活性剂对酶活力的影响中,Mg2+、Mn2+、K+、Na+对各酶有不同程度的促进作用,Cu2+、Ag+、重金属离子对酶有较强的抑制作用,而SDS和EDTA对酶活的影响不显著。 基于纤维素酶实际上是一种复合酶系,且木质纤维素的有效水解需要内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的协同参与,本文利用七种纯化的纤维素酶组分进行了复配研究。 其目的是探讨合适的酶组分配比,也为更合理地使用纤维素酶提供思路。实验中以汽爆秸秆物料作为酶解底物,以酶解液中葡萄糖产量作为表征指标,先通过析因实验找到影响酶解效果的关键因素,随后通过中心组合实验对组分的配比进行了拟合与优化,最后将拟合结果在5 L反应器上进行了验证。结果表明,优化后的多酶复合物配比为(mol％)：Cel7A(19.8％),Cel6A(37.5％),Cel6B(4.7％),Cel7B(17.7％),Cel12A(15.2％),Cel61A(2.3％),β-glucosidase(BG)(2.8％)。5 L反应器上的验证中,优化的多酶体系其酶解汽爆料的葡萄糖产量为15.5 mg/mL,纤维素转化率为70.3％,酶解效果是未优化条件下的2.1倍。利用扫描电镜对酶解液进行观察,证实了优化的多酶复合物将秸秆纤维素“剪切”得更细小、更充分,为直观的观察酶解效果提供了佐证。此外,复配研究中该酶系中限制性因素的发现为绿色木霉的基因工程改造提供更有针对性的思路。 从前期的实验中发现绿色木霉β-葡萄糖苷酶具有较高的稳定性和比酶活,且在酶系中起核心作用,另外也为了阐明该酶在木霉中表达量少的原因,本次实验从合成能力和分泌途径做了分析。实验中采用电泳和免疫胶体金标记的方法,对不同时间酶的合成和胞内外分布进行了观察。结果显示,酶的合成与分泌符合同型蛋白分泌模式,即蛋白在体内边合成、边向外分泌。初始培养条件下酶的分泌率(胞外总分泌蛋白/总合成蛋白)为55.1％。胞内蛋白随时间的分布在菌丝生长早期,酶蛋白主要分布在内质网、液泡和细胞浆区；中期在胞质和细胞器上酶量较少,而主要集中于细胞膜和细胞壁区域；至后期胞内酶颗粒进一步减少,但有部分酶颗粒停留在细胞壁的多糖层。在改变培养条件后,如控制发酵过程pH,外源添加促进剂(2-D-脱氧葡萄糖)或抑制剂(葡萄糖酸内酯)时,发现控制pH和外源添加促进剂能有效提高胞外β-葡萄糖苷酶的活力,酶活分别提高到对照组的3.1和2.5倍；总的β-葡萄糖苷酶的合成量也分别提高了2.4和1.8倍,然而酶的分泌率却没有明显变化,维持在57.8-60.3％左右,这表明木霉所表达的β-葡萄糖苷酶可能存在一个基础分泌率。控制pH和外源添加促进剂时胞内的酶颗粒分布状态与初始条件下类似。这些结果表明,β-葡萄糖苷酶分泌到胞外少的原因主要是受限于自身的合成能力,而与分泌能力的相关度不大。添加抑制剂时,酶合成的量很少,仅有少量可检测水平的量表达；其在细胞中的分布仅在前期(24-48h)可看到少量酶颗粒存在于细胞膜及细胞质区域,这有助于更好地理解和解释组成型β-葡萄糖苷酶的存在。此外,实验结果也表明发酵过程控制方法的改进能增加β-葡萄糖苷酶的产量,但这种增加是有限的,要获得更高产量更高活性的酶,还需要借助分子生物学方法。