一、研究背景和目的对于那些患有严重心脏疾病的病人来讲,心脏移植手术是目前唯一能挽救他们生命并且提高其生活质量的治疗手段。但是和众多器官移植手术类似,心脏移植术后的排斥反应是影响移植心脏发挥正常功能及病人长期存活的最大障碍。虽然免疫抑制剂的使用大大提高了心脏移植术后病人的生存率,但是不能忽视的是免疫抑制剂对机体存在毒副作用并会引起严重并发症。近来,以调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)为基础的细胞治疗方法因其能明显减少移植物术后慢性排斥反应且几乎无任何毒副作用而越来越受到科研界的追捧。然而,调节性T细胞的治疗方案也存在着一些急需解决的问题,例如调节性T细胞在体外较难扩增,调节性T细胞存在不稳定性以及抗原特异性等,这些都影响了其在临床上的广泛应用。因此,更好的了解调节性T细胞的免疫调节机制以及探究影响调节性T细胞生存发育的重要因素对于其在临床上的安全应用及推广至关重要。作为非受体酪氨酸蛋白激酶,哺乳动物Jak激酶家族包括四个进化保守的成员：Jak1,Jak2, Jak3和Tyk2. Jak/STAT作为细胞因子的主要信号转导途径,在免疫应答和免疫反应的产生过程中都发挥关键的作用。当细胞因子与相关细胞表面受体结合后会活化Jak激酶家族,导致Jak激酶在酪氨酸残基上发生自身磷酸化,进而产生锚定位点致使信号传导与转录活化因子(STAT)发生磷酸化。经Jak激活的磷酸化STAT成员接下来会组成同源二聚体或者异源二聚体,这些二聚体会发生核转位,进而调节免疫应答基因的表达。值得注意的是,最近有研究表明针对Jak3的特异性抑制剂可以作为免疫抑制剂,用于治疗移植免疫排斥反应和自身免疫性相关疾病。然而由于IL-2-Jak3-STAT5信号通路对于Treg细胞至关重要,因此当Jak3被抑制后会导致对移植物有保护作用的Treg细胞同时被抑制,这也是限制此种治疗方法广泛应用于预防和治疗临床上移植物急慢性排斥反应的主要原因。Jak激酶家族另外一个重要成员,Jak2激酶参与调控了许多生命活动,例如：细胞的增殖,活化以及分化等。与Jak3激酶不同的是,现在对Jak2激酶功能的研究主要集中在V617F功能获得性突变与恶性血液病的相关性研究。体外实验表明,Jak2对于IL-3, IL-5, IL-12, IFN-y以及单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等信号通路至关重要。种种迹象表明Jak2可能参与体内的免疫应答,因此我们从美国Kay-Uwe Wagner教授实验室引进了一种条件诱导性敲除Jak2基因的小鼠品系,以此来研究Jak2激酶在免疫细胞中的作用。本实验室之前的研究发现,在固有免疫应答中,成年小鼠条件性敲除Jak2基因后,会导致树突状细胞(DC)的发育和成熟障碍。但是,Jak2激酶缺失对适应性免疫应答的影响,尤其是对辅助性T细胞各亚群的影响,我们还是不甚了解。因此,在本实验中我们用成年诱导性Jak2基因敲除的SPF级小鼠,运用小鼠异系异位心脏移植模型探讨Jak2激酶在适应性免疫应答中的作用及其机制。在实验中,发现Jak2基因缺失对于同种异系心脏移植后的排斥反应有免疫保护作用,其机制主要是通过抑制具有促炎作用的Th1细胞亚群以及相对增加具有免疫调节作用的Treg细胞亚群来实现。二、实验方法和结果首先给8周龄Cre+/+-Jak2fl/fl小鼠连续5天腹腔注射特莫西芬,诱导其特异性敲除Jak2基因。分析Jak2缺失小鼠发现,相对于对照组小鼠来说,Jak2基因缺失小鼠表现出明显的脾脏细胞数量减少的现象。更有趣的是,我们用流式细胞术检测发现,Jak2基因缺失小鼠脾脏细胞中,几乎没有髓系来源的细胞,这和我们之前研究发现Jak2基因缺失导致DC细胞生存发育障碍的结论一致,与此相反的是淋巴系来源的细胞比例明显增多。和这一现象一致的是,CD4阳性T细胞在脾脏总细胞中所占的比例相对于对照组来说增加了一倍。我们同时发现Jak2基因缺失小鼠的外周血中淋巴系细胞和CD4阳性T细胞比例也明显增高。由于Jak2基因缺失会影响淋巴系来源细胞,那么接下来我们开始探讨Jak2是具体影响到哪些T细胞亚型。我们分别提取Jak2基因缺失和野生型小鼠脾脏细胞,通过流式抗体标记CD3, CD4和CD8,结果发现在CD3阳性T细胞中,Jak2基因缺失并没有改变CD4和CD8阳性T细胞的比例,以上结果在淋巴结和外周血中也得了到证实。然而有趣的是,我们发现在Jak2基因缺失小鼠体内,CD4+CD44high CD62Llow效应或记忆性T细胞(TEM细胞)比例明显降低,同时分泌IFN-y的Th1细胞比例也明显减少。与此相反的是,CD4+Foxp3+Treg细胞的比例在Jak2基因缺失后明显升高。接下来我们使用naive T细胞试剂盒分别从Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠的脾脏中分选出CD4+CD44lowCD62Lhigh naive T细胞,然后将这些细胞分别在Th1和reg细胞培养环境中培养,最后用流式细胞术分别检测IFN-y阳性T细胞和foxp3阳性T细胞来确定Jak2激酶缺失是否会对naive T细胞的定向分化产生影响。结果发现,野生型小鼠来源的naive T细胞能够很好的分化为分泌IFN-γ的Th1细胞,而Jak2基因缺失小鼠来源的naive T细胞几乎不能分化为Th1细胞。为了进一步确认以上分化结果,我们在Th1细胞定向分化培养环境中又额外的加入了细胞因子IFN-γ,结果发现细胞因子IFN-γ能够进一步提高WT小鼠来源的naive T细胞的定向分化能力,但是细胞因子IFN-y并没有逆转由于Jak2基因缺失而导致的naive T细胞不能分化为Th1细胞的现象。有趣的是,与野生型小鼠相比,Jak2基因缺失后不但没有影响naive T细胞分化为Treg细胞,反而促进了此过程。尤其是在Treg细胞定向分化培养环境中加入了抗CD28抗体刺激后,Jak2基因缺失小鼠来源的naive T细胞分化为Treg细胞的能力进一步提高。根据以上结果发现,Jak2基因缺失后一方面抑制了Thl细胞的发育,另一方面又促进了Treg细胞的分化发育,这让我们联想到Jak2激酶是否会参与同种异体移植物排斥反应,因为这种排斥反应主要是由CD4阳性T细胞介导。为了证明这个假设,我们运用小鼠异系异位心脏移植模型,即将BABL/c (H-2d)来源的小鼠心脏移植到与其有不同遗传背景(H-2b)的Jak2基因缺失小鼠或对照野生型C57BL/6J (H-2b)小鼠的腹部。经过观察发现,Jak2基因敲除后相对于野生对照组来说能够明显延长心脏移植物的存活时间(平均生存期为58±30.6天vs.7±0.3天,p<0.001)。接下来我们对小鼠移植后的心脏做了病理学检查,由此来确定以上实验结果的准确性。我们在心脏移植术后第6天取出心脏移植物,经过固定包埋后,做成病理切片,然后通过HE染色观察到对照野生型小鼠的移植心脏中有大量的炎症细胞浸润,而且心肌细胞也大量的被破坏。与此相反的是,Jak2基因缺失小鼠的移植心脏中几乎看不到炎症细胞浸润,而且心肌细胞完好无损。随后将移植6天后的心脏组织提取RNA,通过real-time PCR技术检测两组移植心脏中的炎症性细胞因子和趋化因子的差别。我们发现在对照野生型组移植心脏中高表达IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-6, IL-12p40和CCL-2等,而在Jak2基因缺失小鼠移植心脏中上述炎症因子含量很低,尤其是IFN-γ和IL-12p40几乎检测不到。之前的实验结果表明Jak2激酶会影响小鼠体内辅助性T细胞亚群的构成比,因此接下来我们想比较一下心脏移植术后的Jak2基因缺失心脏移植受体小鼠和野生型心脏移植受体小鼠体内辅助性T细胞亚群的比例差异。首先取出移植术后6天各组小鼠的脾脏,通过流式细胞术我们发现在脾脏细胞中,Jak2基因缺失受体小鼠产IFN-y的Thl细胞亚群比例明显低于野生型受体小鼠,于此相反的是’Treg细胞亚群比例高于野生型受体小鼠。在心脏移植物引流淋巴结中也得到了相同的结果。众所周知,Treg细胞是一群具有免疫调节功能的细胞,因此我们想探讨Jak2基因缺失是否会影响到Treg细胞的功能。首先用Treg细胞分选试剂盒从Jak2基因缺失和野生型心脏移植受鼠脾脏中分选出CD4+CD25+Treg细胞,然后从正常野生型小鼠脾脏中分选出CD4阳性效应T细胞。接下来用CFSE标记被抗CD3抗体刺激活化的CD4阳性效应T细胞,然后将其分别以不同比例与Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠来源的CD4+CD25+Treg细胞混合培养。发现Jak2基因敲除的Treg细胞其免疫抑制能力与WT小鼠来源的Treg细胞相当,这说明Jak2激酶并不影响Treg细胞的免疫抑制功能。Jak2基因缺失是否会影响到CD4阳性T细胞的增殖能力呢?为了阐明这个问题,我们分别从Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾脏中分选出CD4阳性T细胞,然后用CFSE标记这些细胞,接下来用抗CD3抗体+抗CD28抗体或PMA+离子霉素刺激这些CD4阳性T细胞。和我们预想的一样,经过刺激后Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾脏来源的CD4阳性T细胞表现出类似的增殖能力,这说明Jak2激酶并不参与CD4阳性T细胞的增殖过程。为了确认以上结果的准确性,我们用混合淋巴细胞共培养实验来评估同种异系抗原刺激的增殖过程。首先体外培养准备BALB/c小鼠骨髓来源的DC细胞(bone marrow-derived DC),然后用丝裂霉素C处理DC细胞让它们不能分裂增殖,接下来用这些DC细胞在体外培养刺激Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠脾脏来源的CD4阳性T细胞。和之前体外刺激实验一致,Jak2基因缺失的CD4阳性T细胞经过同种异系抗原刺激后其增值能力与野生型小鼠来源的CD4阳性T细胞相当。为了探讨Jak2基因缺失是通过哪条信号通路影响Thl细胞和Treg细胞之间的动态平衡,我们首先在CD4阳性T细胞中检测各种细胞因子导致的Jak2激酶活性的改变。我们从野生型小鼠脾脏中分选出CD4阳性T细胞,然后分别用IFN-y, IL-12和IL-2去刺激细胞,然后用western blot方法检测p-Jak2激酶蛋白水平的变化。我们发现,经过IFN-y或IL-12刺激后,p-Jak2激酶明显增多,而IL-2刺激后的CD4阳性T细胞中的p-Jak2激酶几乎检测不到。以上结果提示我们去检测经过IFN-y或IL-12刺激后,Jak2激酶下游到底是哪些信号分子发生了改变。我们发现,在静息状态下,野生型和Jak2基因缺失小鼠来源的CD4阳性T细胞中p-STAT4几乎检测不到,但是经过IL-12刺激后,野生型小鼠来源的CD4阳性T细胞中p-STAT4明显提高,而Jak2基因缺失小鼠来源的CD4阳性T细胞中p-STAT4依旧检测不到。与此类似的是,细胞因子IFN-y能诱导野生型来源CD4阳性T细胞高表达p-STAT1,而虽然经过IFN-y刺激,Jak2基因缺失小鼠来源的CD4阳性T细胞中p-STAT1仍然几乎检测不到。有趣的是,经过细胞因子IL-2刺激后,Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠来源的CD4阳性T细胞都能诱导高表达p-STAT5,并且两组之间差别不大。综合以上结果我们得知,Jak2激酶缺失后能够选择性的抑制IL-12/STAT4和IFN-y/STAT1信号通路,进而减弱了naive T细胞定向分化为Thl细胞的能力。与此相反的是,Jak2激酶对于IL-2/STAT5信号通路来说是非必要的,所以Jak2激酶缺失后并不影响到Treg细胞的发育。由于Jak2激酶缺失并不影响IL-2/STAT5信号通路,那么Jak2基因缺失小鼠体内Treg细胞比例升高的原因可能是由于IL-12和IFN-y信号通路受损,导致在体内缺失了IFN-y的环境中,Jak2基因缺失小鼠来源的naive T细胞更倾向于分化为Treg细胞。为了弄清楚Jak2基因缺失到底是通过哪些更深层的机制来影响Thl细胞亚群的发育,我们需要检测Jak2基因缺失后对于Thl细胞相关转录因子的影响,例如T-bet蛋白(转录因子T box 21)和Hlx (H 2.0-like homeobox),其中T-bet作为Thl的主调控因子参与Th1的分化,而Hlx能够诱导Thl细胞分泌IFN-y,进而维持Thl细胞的稳态。首先,我们用naive T细胞试剂盒分别从Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾脏中分选出naive T细胞,然后将这些细胞放在Thl细胞定向分化培养条件下培养,最后用western blotting方法检测以上两个Thl细胞相关转录因子的蛋白表达水平。我们发现来自于野生型小鼠的naive T细胞经过定向分化后,细胞蛋白中T-bet和Hlx蛋白表达明显增多。与此相反的是,Jak2基因缺失的naive T细胞经过定向分化以后,细胞中T-bet和Hlx蛋白几乎检测不到。为了进一步确认以上结果,我们又检测了Runx3 (Runt相关转录因子3)的表达,Runx3主要是和T-bet协同作用来保证Thl细胞的分化。结果发现,Runx3蛋白表达和T-bet一样,在野生型小鼠来源的分化细胞中表达明显增高,而在Jak2基因缺失小鼠来源的分化细胞中几乎检测不到。接下来我们又检测了T-bet下游的信号通路,结果发现虽然Jak2基因敲除以后抑制了T-bet的表达,但是这一过程并没有完全抑制T-bet诱导蛋白之一IL-12Rβ2的表达。综合以上实验结果,我们得出一下结论：Jak2基因缺失主要是通过抑制Thl细胞转录因子T-bet/Hlx以及相关协同转录因子Runx3的表达,进而影响到Thl细胞的分化。三、结论综上所述,Jak2激酶缺失以后导致了Th1细胞发育障碍,但是促进了有免疫调节功能的Treg细胞的发育分化,这说明Jak2激酶在Th1/Treg细胞之间的免疫平衡中起到了非常关键的作用。我们也用小鼠异位心脏移植模型验证了以上结论,Jak2基因敲除明显延长了心脏移植物的存活时间。我们的细胞学检测发现,Jak2激酶缺失与否并不影响CD4 T细胞的增殖能力。机制实验我们发现Jak2激酶缺失主要是通过减弱IFN-y/STAT1和IL-12/STAT4信号通路,以及抑制Thl细胞相关转录因子T-bet, Hlx和Runx3的表达,进而阻碍了Thl细胞分化发育。与此相反的是,Jak2激酶缺失并不影响IL-2/STAT5信号通路,由于此信号通路在Treg细胞分化发育中起关键作用,因此Jak2激酶缺失并不影响Treg分化,甚至由于缺乏Thl细胞的影响而促进Treg的分化发育。总的来说,我们的结果表明Jak2激酶在未来可以作为一个治疗靶点应用于预防和治疗临床上的移植物急慢性排斥反应等疾病。