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嫩度是评价肉质的重要指标,也是影响消费的因素之一,宰后成熟是嫩度改善的主要方法,钙激活酶、细胞凋亡酶等内源酶对肌原纤维蛋白的有限降解是成熟过程中嫩度改善的主要原因。近年来研究发现热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）能对宰后肌肉嫩度的改善产生一定影响,但目前有关HSPs对欧拉藏羊宰后嫩度作用的机制研究未见报道。欧拉藏羊是我国高寒牧区的优良代表品种之一,常年露营放牧,因其肉的嫩度较养殖条件下差,影响其食用加工品质。本文以24头欧拉藏羊为研究对象,研究了肌肉中HSP70、HSP90表达量的变化规律及与肉品质的关系;从细胞内环境因素变化的角度分析了HSP70、HSP90对p H、ATP含量、细胞能量代谢酶、内源性抗氧化酶系统及ROS、MDA水平变化的影响;明确了HSP70、HSP90对凋亡酶、凋亡因子、细胞形态学和肌纤维微观结构变化的影响;利用免疫印迹和免疫组化技术,通过体内体外实验揭示了HSP70、HSP90对肌原纤维蛋白降解的内在本质,最终阐明HSP70、HSP90对藏羊肉嫩度影响的机制,为改善其嫩度,开发利用欧拉藏羊肉资源提供理论依据。主要研究结果如下:1.研究了宰后欧拉藏羊肉HSP70、HSP90表达量的变化规律。HSP70表达量在宰后初期0～12h逐渐升高,在12h达到最高值后显著下降（p<0.05）,HSP90表达量变化趋势和HSP70相一致。相关分析表明,HSP70的表达量与MFI呈极显著的负相关（p<0.01）,与L*值呈显著的负相关（p<0.05）,与剪切力值、糖原含量呈显著的正相关（p<0.05）,与系水率呈极显著的正相关（p<0.01）;HSP90的表达量与MFI、L*值呈显著的负相关（p<0.05）,与剪切力、糖原和系水率呈显著的正相关（p<0.05）;HSP70和HSP90与a*、b*值均无显著的相关性。表明HSP70、HSP90的变化对欧拉藏羊肉品质有影响。2.明确了HSP70、HSP90是通过影响欧拉藏羊肉肌细胞内环境、能量代谢酶和内源性抗氧化酶的活性,延缓了细胞凋亡的发生。HSP70、HSP90抑制剂处理组p H值和ATP含量均显著低于对照组（p<0.05）,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力显著高于对照组（p<0.05）,SOD、CAT、GSH-PX的活性显著低于对照组（p<0.05）,ROS水平显著高于对照组（p<0.05）,MDA含量显著高于对照组（p<0.05）,这表明HSP70、HSP90能改变机体p H值和ATP的含量,降低能量代谢酶Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase的活力,提高内源性抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX的活性,抑制ROS的释放和MDA产生,在一定程度上抑制了细胞凋亡的发生。3.明确了HSP70、HSP90对欧拉藏羊肌细胞形态学及超微结构变化的影响。与对照组相比,HSP70和HSP90抑制剂处理加快了藏羊肌细胞核肌纤维皱缩的速度,加速了肌纤维降解程度,处理组肌纤维面积、肌纤维直径显著低于对照组（p<0.05）,肌细胞间隙显著高于对照组（p<0.05）,相关分析表明,HSP70、HSP90的表达量均与肌纤维面积、肌纤维直径呈极显著正相关（p<0.01）,HSP70的表达量与肌细胞间隙呈显著负相关（p<0.05）。表明HSP70、HSP90能有效延缓肌纤维皱缩速度,保护肌原纤维蛋白免受降解,延缓肌肉成熟嫩化过程。4.明确了HSP70、HSP90对欧拉藏羊肉肌细胞凋亡酶的活性、凋亡因子和凋亡率的影响。HSP70抑制剂处理组Caspase-3和Caspase-9的活性显著高于对照组（p<0.05）,Bax的含量显著高于对照组（p<0.05）,Bcl-2水平显著低于对照组（p<0.05）,Bax/Bcl-2的比值显著高于对照组（p<0.05）,细胞凋亡率显著高于对照组（p0.05）,Bax/Bcl-2的比值显著高于对照组（p<0.05）,细胞凋亡率显著高于对照组（p<0.05）。HSP70、HSP90能抑制细胞凋亡酶的活性,降低凋亡因子Bax/Bcl-2的比值及细胞凋亡率。5.确定了HSP70、HSP90对宰后藏羊肉肌原纤维骨架蛋白降解的抑制作用。免疫印迹和免疫组化试验结果表明,成熟期间藏羊肉Desmin和Troponin-T表达相对含量均呈逐渐降低的趋势,HSP70抑制剂处理Desmin和Troponin-T表达相对含量显著低于对照组（p<0.05）;HSP90抑制剂处理Desmin表达相对含量低于对照组,仅在12h和72h与对照组差异显著（p<0.05）,Troponin-T表达相对含量与对照组相比,在宰后24h和168h差异显著（p<0.05）;宰后藏羊肉Titin、Nebulin的表达量呈下降趋势,降解率逐渐增大,宰后12～168h,HSP70抑制剂处理组其降解率分别增加了53.68%和47.12%,HSP90抑制剂处理组降解率分别增加了33.07%和32.90%;成熟期间两处理组Titin和Nebulin的降解率均极显著高于对照组（p<0.01）,这表明HSP70、HSP90对Desmin、Troponin-T、Titin和Nebulin的降解有抑制作用,延迟了肌肉宰后成熟嫩化的进程。6.确定了HSP70、HSP90能抑制Desmin和Troponin-T降解的本质原因是HSP70、HSP90能抑制Caspase-3和μ-calpain的活性。体外实验表明,Caspase-3能够在体外降解Troponin-T和Desmin,而外源性HSP70、HSP90的添加对这种降解有明显抑制作用;μ-calpain加快了Desmin和Troponin-T的体外降解,外源性HSP70、HSP90的添加抑制了蛋白的降解,而单独的外源性HSP70、HSP 90对肌原纤维蛋白的降解无显著影响,这说明HSP70、HSP90可通过抑制细胞凋亡酶和钙激活酶来抑制Desmin和Troponin-T的降解。7.揭示了HSP70、HSP90对欧拉藏羊肉嫩度影响的可能机制。一是HSP70和HSP90通过影响欧拉藏羊肉肌细胞内环境、能量代谢酶和抗氧化物酶,而抑制了细胞凋亡上游的激活过程而影响了嫩度。二是HSP70和HSP90对宰后肌细胞结构的完整性有保护作用,保持肌原纤维的结构完整,免受降解,延缓其成熟嫩化。三是HSP70、HSP90可通过抑制细胞凋亡酶和钙激活酶而抑制肌原纤维蛋白的降解,进而延缓嫩化过程。综上所述,欧拉藏羊宰后HSP70和HSP90表达对肉嫩度产生了影响,HSP70和HSP90能延缓细胞内环境的酸化,降低ATP的损耗,提高SOD、CAT、GSH-PX的活性,减少ROS的释放,降低MDA的产生,降低Caspase-3和Caspase-9的活性及Bax/Bcl-2的比值,抑制细胞凋亡的发生,不利肉的嫩化;同时,HSP70和HSP90对宰后细胞结构的完整性有保护作用,可通过抑制细胞凋亡酶和钙激活酶对细胞骨架蛋白的降解有明显的抑制作用,延缓肉的成熟嫩化进程。本文从细胞内环境及细胞凋亡、肌细胞结构变化、肌原纤维蛋白降解三个层面,揭示了HSP70、HSP90对欧拉藏羊肉嫩度的作用机制,为其嫩度的改善和精深加工提供理论依据和数据支持。