拟南芥茎尖干细胞的分离与培养

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动物干细胞系自1981年利用小鼠胚胎首次建立之后,迅速得到发展并广泛应用于医学和临床研究,同时通过控制体外培养条件控制干细胞的维持与定向分化,为胚胎及个体发育过程中未知基因及调控因子的鉴定和功能分析提供良好的材料和方法。植物干细胞与动物干细胞功能以及维持与分化机制方面都有极高的相似性。然而由于植物细胞具有细胞壁,这一细胞特性导致植物细胞以细胞团的形式存在,难以实现单个细胞的分离培养,导致植物干细胞系的建立进展缓慢。目前报道仅限于红豆杉、人参等起始于次生分生组织形成层细胞的细胞系以及水稻静止中心(quiescent center,QC)起始的细胞系,但这些细胞系仅呈现细胞形态方面证据,缺乏遗传学特征、基因组学及再生方面的证据。  本研究借鉴了形成层细胞系和静止中心细胞系建立的实验思路,以模式植物拟南芥的茎顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)为材料,利用SAM特异表达的marker CLV3为干细胞状态的标记,探索建立起始于拟南芥茎尖的干细胞系。通过优化培养体系,成功利用SAM分离出分散的细胞,其细胞胞间连接较弱,可呈单细胞状态存在;细胞呈圆形或椭圆形;体积较小,约20-50μm;细胞核较大,占细胞面积20%-50%。这些形态学特征均符合干细胞特征的报道。此外,分离得到的细胞特异地表达CLV3,且对其进行细胞倍性的分析发现,这些细胞仅包含二倍体和四倍体两种倍性的细胞。这几个方面的证据证明了分离出的细胞是一种分化程度较低的多潜能干细胞或全能干细胞。  本研究后续工作尝试利用分离得到的干细胞建立一个稳定的干细胞系。在建立液体悬浮细胞系之初,从基本培养基类型、激素浓度、糖浓度等方面优化了悬浮细胞体系。然而现有的培养体系在继代过程中均出现了干细胞比例有所下降的现象,这个结果表明现有的液体培养体系不能成功维持干细胞的状态。目前动物干细胞的培养基中必须添加一种细胞分化抑制因子(differentiation inhibitory activity,DIA),因此考虑是否建立植物干细胞系也需要一种起抑制细胞分化的关键因子。尝试添加了干细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)和超长链脂肪酸抑制剂(metazachlor,Meta),未能得到显著的干细胞维持效果。  综上所述,本研究通过探索建立了拟南芥茎尖干细胞的分离体系,成功分离得到多能或全能干细胞,并为接下来探索干细胞系的继代培养体系打下了一定的基础。
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