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目的:挤压综合征是指挤压物持续挤压机体后造成不同程度的肌肉损伤,当解除挤压后出现以肌红蛋白尿、高血钾、酸中毒等为特点的全身炎性反应综合征。其中急性肾损伤是最重要的并发症之一,也是导致死亡率居高不下的重要因素。挤压综合征导致全身应激状态下的肾缺血性改变,同时释放大量的肌红蛋白到血液,随血液循环进入肾脏,出现酸性的正铁血红蛋白管型,导致肾小管阻塞并出现毒性反应,最终导致急性肾损伤的发生。挤压综合征的早期治疗是降低伤者死亡率的关键措施,但目前国内外尚无公认有效的治疗方案。本课题通过研究和探讨TLR4/NF-κB信号通路在挤压综合征相关急性肾损伤的作用机制,旨为临床预防和治疗挤压综合征相关急性肾损伤提供实验基础和理论依据。方法:本研究分为四部分:第一部分:建立大鼠挤压伤模型,固定挤压强度3kg,挤压16h,根据不同解压处理时间分4组（0h,6h,12h,24h）,HE染色法观察肾脏组织病理改变;分别检测TLR4、TLR4m RNA、CK18及p65表达,检测血清IL-6、TNF-ɑ表达水平及肾损伤相关指标（尿素氮,肌酐、肌红蛋白、血钾）。第二部分:正常大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞分别加入正常大鼠血清（1,2ml）及大鼠挤压伤模型血清（1,2ml）,根据TLR4表达筛选最适血清浓度并分组:空白对照组、对照血清组和挤压血清组。观察肾小管上皮细胞NRK-52E细胞的形态改变;检测细胞增殖/毒性;检测细胞周期及凋亡;检测TLR4、p65定位表达及细胞核/浆磷酸化及总p65表达;检测血清IL-6、TNF-ɑ表达水平。第三部分:设计合成并包装TLR4 si RNA慢病毒,选择合适的MOI依据对NRK-52E细胞不同干预方法分为6组:空白对照组、对照血清组、挤压血清组、挤压血清+si RNANC组、挤压血清+TLR4si RNA组、挤压血清+TAK-242组。观察肾小管上皮细胞NRK-52E细胞形态改变;检测细胞增殖/毒性;检测细胞周期及凋亡;检测TLR4、P65定位表达及细胞核/浆磷酸化及总p65表达;检测血清IL-6、TNF-ɑ表达水平。第四部分:二次建立大鼠挤压伤模型,根据第一部分实验结果选取变化最显著的挤压组12h进行分组,共3组:对照组、挤压组12h、挤压组12h+TAK-242组。观察大鼠肾脏组织及肌肉组织病理HE染色;检测TLR4、TLR4m RNA、CK18及p65表达;检测血清IL-6、TNF-ɑ表达水平及肾损伤相关指标（尿素氮,肌酐、肌红蛋白、血钾）。结果:一、与对照组相比,挤压组肾小管上皮细胞排列紊乱,出现空泡现象,解压12h组细胞破坏最为显著;挤压组尿素氮,肌酐、血钾、TLR4蛋白、TLR4 m RNA、p65、IL-6、TNF-ɑ表达显著升高,解压12h组表达水平最为显著。免疫组化中挤压组p65表达与对照组相比无显著差异。免疫荧光染色TLR4和P65表达与对照组相比显著升高,不同挤压组之间无显著差异。二、选择5%终浓度进行后续实验。光镜观察各组细胞形态无显著差异;挤压血清组G1期的比例增加,可能发生G1期阻滞;与空白对照组和对照血清组相比,挤压血清组TLR4蛋白、TLR4m RNA、细胞活性氧含量、细胞核中磷酸化p65、IL-6及TNF-α表达显著升高;细胞增殖速度显著降低;空白对照组和对照血清组之间无显著差异;细胞浆中三组总NF-kappa Bp65表达量无显著差异。三、选择MOI=30进行后续实验。光镜观察各组细胞形态无显著差异;与空白对照组、对照血清组、挤压血清+TLR4 si RNA组和挤压血清+TAK-242组相比,挤压血清组和挤压血清+si RNA NC组细胞增殖速度显著降低;G1期比例显著增加;细胞内活性氧含量有所增加;TLR4蛋白、TLR4m RNA、细胞核中磷酸化p65、IL-6及TNF-α表达显著升高;与空白对照组和对照血清组相比,挤压血清+TLR4 si RNA组和挤压血清+TAK-242组增殖速度稍降低;G1期比例、细胞内活性氧含量无显著差异;TLR4蛋白、TLR4m RNA、细胞核中磷酸化p65、IL-6及TNF-α表达无显著差异;细胞浆中各组总NF-kappa Bp65表达量无显著差异。四、与对照组相比,挤压组肾脏、肌肉组织排列疏松、不规则、有显著空泡产生;挤压组12h+TAK-242组较挤压组损伤程度低;与对照组相比,挤压组TLR4m RNA、TLR4蛋白、p65、IL-6及TNF-α表达水平显著升高;挤压+TAK-242组TLR4m RNA、TLR4蛋白、p65、IL-6及TNF-α表达水平显著低于挤压组,稍高于对照组。结论:一、大鼠挤压伤模型导致挤压综合征相关急性肾损伤的发生:肾脏组织病理性改变、肾功能异常升高、血清肌红蛋白浓度及血钾浓度异常升高,诱导急性肾损伤的发生,促进释放IL-6及TNF-α炎性因子。二、TLR4/NF-κB信号通路介导大鼠挤压综合征相关急性肾损伤的发生发展。三、通过抑制TLR4的表达,可有效抑制TLR4/NF-κB信号通路,显著减轻大鼠挤压综合征相关急性肾损伤的严重程度,降低IL-6、TNF-α炎性因子的释放,从而有效减轻炎性反应的发生。