背景和目的：　　透明质酸酶的定义是能水解透明质酸的酶。透明质酸酶根据结构的不同可分为3类，人类和大多数动物来源的透明质酸酶属于EC3.2.1.35，蜂毒来源的透明质酸酶属于EC3.2.1.36，微生物来源的透明质酸酶属于EC4.2.2.1。透明质酸酶有基础研究和应用研究，基础研究主要在透明质酸酶的分离纯化和相关性质等方面；应用研究主要在眼科、麻醉、制备低分子透明质酸和制备生物毒素透明质酸酶抗体等方面，透明质酸酶的基础研究可为其应用研究提供实验基础。　　蛇毒中蛋白和多肽种类繁多，透明质酸酶是蛇毒中一种重要的蛋白质，其主要作用是破坏细胞内外基质，辅助蛇毒局部和体内的扩散，故又名“扩散因子”。由于透明质酸酶本身无毒性，无直接致病性，因此在生物毒素中的研究长期被忽略。　　每种蛇毒来源的透明质酸酶都是独特的。　　舟山眼镜蛇（Naja atra Cantor）是常见于中国南部的一种眼镜蛇，其蛇毒的研究多集中于抗肿瘤、镇痛等，目前尚未见舟山眼镜蛇毒透明质酸酶的报道。舟山眼镜蛇是华南地区优势蛇种，本课题组在舟山眼镜蛇细胞毒素抗肿瘤和镇痛方面有深入研究，如果能进一步对透明质酸酶进行研究可以为本地区的蛇伤救治及单价抗体的制作提供实验基础，也能够在分离细胞毒素的同时分离透明质酸酶，保护生物资源的同时还可以使生物资源充分利用，节约研究和将来的应用成本。　　然而，蛇毒透明质酸酶的分离是透明质酸酶研究的主要难点，主要原因是透明质酸酶在蛇毒中的含量较少，例如印度眼银镜蛇毒透明质酸酶含量为0.1635%，尖吻蝮蛇毒透明质酸酶含量为0.14%，含量少致使蛇毒分离时透明质酸酶容易丢失；另外一个原因则是分离过程中酶的活性检测方法不完善，灵敏度低，易在检测过程中出现假阴性，致使酶活性倍数的提高不明显。　　本论文主要对舟山眼镜蛇毒透明质酸酶进行分离纯化，并对纯化的透明质酸酶的性质进行研究。针对蛇毒透明质酸酶分离纯化和性质鉴定方法上的不足，本论文还对酶活性测定方法CTAB浊度法进行了改良，明显的提高了其敏感性，并申请了发明专利（申请号：201511028040.8）。　　实验方法：　　1.舟山眼镜蛇毒透明质酸酶的分离纯化　　1.1 分别用4种不同的流速对蛇毒粗毒进行Sephadex G-50凝胶层析初步分离；　　1.2 用考马斯亮蓝染色和CTAB法分析Sephadex G-50II峰（简称II峰）；　　1.3 用CM Sepharose Fast Flow层析进一步纯化II峰透明质酸酶；　　1.4 用考马斯亮蓝染色测定蛋白纯度和CTAB法测定透明质酸酶活性。　　2.舟山眼镜蛇毒透明质酸酶H2的性质研究　　2.1 H2的专一性；　　2.2 H2的最适活性；　　2.3 不同溶液对H2稳定性的影响；　　2.4 不同离子对H2活性影响；　　2.5 H2的水解产物分析；　　2.6 H2的Km值和Vmax。　　实验结果：　　1.舟山眼镜蛇毒透明质酸酶的分离纯化　　1.1 四个不同流速洗脱液得到的G50II峰层析图、II峰冻干蛋白、酶活力及II峰染色图相比较无明显差异，根据层析图选择1.4ml/min流速；　　1.2 用CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析法进一步纯化可得到两个透明质酸酶活性峰，分别命名为H1和H2；　　1.3 用考马斯亮蓝染色对H1和H2峰检测，H2峰可得到单一条带，达到电泳纯，经过mark进行分子量测定，H2蛋白分子量为57.7KDa；并命名为H2透明质酸酶，简称H2。　　2.舟山眼镜蛇毒H2透明质酸酶的性质研究　　2.1 H2专一，只能水解透明质酸（Haluronic acid，HA）；　　2.2 H2最适温度为40℃，最适pH值为4，最适离子强度为0.2M；　　2.3 H2溶于pH=4或5的醋酸钠缓冲液中最为稳定；　　2.4 Na+/K+/Mg2+是H2激活剂，Fe3+/Ba2+/Al3+为其不完全抑制剂，Cu2+/Ca2+为其完全抑制剂；　　2.5 H2水解HA产物主要为4糖和6糖；　　2.6 H2的Km=56.3μg/ml，Vmax=3.93μg/min。　　附1：CTAB浊度法快速测定透明质酸酶活性的研究　　十六烷三甲基溴化铵（CTAB）与透明质酸结合产生浊度，并与透明质酸量成线性相关。改用酶标仪代替紫外分光光度计来检测CTAB与透明质酸结合产生的浊度取得良好的效果。在实验过程中发现离子强度和pH值对CTAB与透明质酸结合产生浊度有较大的影响。系统性的观察离子强度与pH值对CTAB与透明质酸结合产生浊度的影响，其结果示：离子强度越高，CTAB与透明质酸结合产生的浊度值越少，0.6M以上不产生浊度；pH值的影响较为温和，当pH值≥5时对CTAB浊度法基本无影响，pH值=3时CTAB与透明质酸结合不产生浊度。运用CTAB与透明质酸结合的原理来测透明质酸酶活性，对方法进行改良，大大提高了其敏感性，并申请了发明专利（申请号：201511028040.8）。　　附2：透明质酸酶荧光辅助糖电泳的研究　　透明质酸酶水解HA的产物经荧光标记后，PAGE电泳直观的看到低分子量的HA，根据电泳图可半定量透明质酸酶活性，且能直观的看到透明质酸酶水解HA的产物。目前尚未见用FACE法研究透明质酸酶的报道，为保证方法的准确性，实验验证35%凝胶浓度，165min电泳时间为合适条件；荧光标记特异性强，可减少杂质的影响；加样量与电泳条带呈正相关；0-0.4M NaCl离子强度和pH值=2-8对FACE无影响。FACE法为透明质酸酶的研究提供了一种新的实验方法。　　结论：　　1、首次从舟山眼镜蛇毒纯化了一个分子量为57.7KDa的H2透明质酸酶；H2相关性质的研究为H2的开发应用提供了实验依据；　　2、改良了CTAB浊度法并申请了发明专利（申请号：201511028040.8）；　　3、FACE法为透明质酸酶的研究提供了一种新的实验方法。