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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能够引发猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是使怀孕母猪发生流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸困难的一种高度传染性疾病。自1987年在美国首次发现PRRS以来,该病迅速传播到所有主要养猪国,是影响全球养猪业的最重要疾病之一。我国于1996年初次报道PRRS,2006年一种高致病性HP-PRRSV引发的高致病性PRRS的出现并流行,给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。实验室课题组前期结果发现miR-373能通过负向调控Ⅰ型干扰素促进PRRSV的复制,而靶基因预测软件结果表明甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1(CREB1)可能是miR-373的靶基因。那么miR-373是否通过靶向MBD2和CREB1而促进PRRSV复制,而且MBD2和CREB1是否是抗PRRSV的宿主内源性蛋白,目前还不清楚。本实验首先构建MBD2和CREB1的3’-UTR报告质粒,分别与miR-373模拟物和抑制物及其各自对照共转染293T细胞,双荧光素酶报告实验结果表明MBD2和CREB1是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PPRSV感染MARC-145细胞,24h、36h和48h后,分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blots实验结果表明PRRSV感染下调MBD2和CREB1的mRNA和蛋白的表达水平。为了确证MBD2和CREB1是否是抗PRRSV的宿主内源性蛋白,我们用真核表达载体pcDNA3.1-Flag分别构建了 MBD2和CREB1的真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-MBD2 和 pcDNA3.1-Flag-CREB1,将真核表达质粒 pcDNA3.1-Flag-MBD2 和pcDNA3.1-Flag-CREB1 分别转染 MARC-145 细胞,24h 后,按 MOI=0.1 接种 PRRSV,24h 后收获细胞,TCID50的实验结果表明过表达MBD2和CREB1均能降低PRRSV滴度,而qRT-PCR和western blots的结果则表明MBD2和CREB1均能降低PRRSV的载量;相反,MBD2和CREB1的siRNA实验表明下调二者表达均有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。最后,通过基因缺失实验,构建MBD2和CREB1部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域以及CREB1的bZIP结构域可能在MBD2和CREB1抑制PRRSV复制起关键的作用。综上所述,本研究发现MBD2和CREB1是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域以及CREB1的bZIP结构域可能在MBD2和CREB1抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2和CREB1的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。因此,本研究进一步揭示了 PRRSV逃逸宿主清除的分子机理,并为PRRSV的防控提供了新靶点。为开发基于该内源性抗病毒蛋白的抗病毒治疗提供了理论依据。