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喉癌是最常见的头颈恶性肿瘤之一，全球每年约有190，000例新增喉癌病例，并且其发病率有增高趋势。晚期喉癌经手术或术后辅以放疗或化疗的5年生存率不足60％，术后造成喉功能全部或部分丧失，生活质量明显下降，严重的威胁着人类的生命和健康。
基因治疗是治疗恶性肿瘤的最具有潜力的新方法，由于肿瘤的发生、发展及转移是多因素及多阶段的复杂过程，联合基因治疗可从多个环节控制肿瘤的发生及发展，提高基因治疗的肿瘤抑制率和抗肿瘤免疫效应，降低其毒副作用。目前国内外学者进行的有关联合基因抑制肿瘤的实验，均存在联合基因构建操作复杂，容易突变，肿瘤抑制效果不理想，选择的基因治疗窗小等不足，同时未见有胞嘧啶脱氨酶(eytosinedeaminase，CD)基因联合肿瘤坏死因子-α(toumornecrosisfactor-α，TNF—α)基因治疗喉癌的实验研究。
自杀基因前体药物系统CD/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)将无毒性前药5-Fc转化为细胞毒产物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，从而阻止DNA合成，使靶细胞走向死亡。TNF—α能充分调动机体的抗肿瘤免疫反应，对肿瘤有直接杀伤作用，损伤肿瘤组织微血管。两种基因的肿瘤抑制机制不同，而且有协同作用，因而可以从多个环节抑制肿瘤生长，达到优势互补，提高肿瘤抑制率及抗肿瘤免疫反应的目的。
质粒载体pcDNA3.1(+)跟常用的病毒载体比较，具有无免疫原性、安全、能稳定遗传等特点。另外pcDNA3.1(+)中CMV启动子来源于巨细胞病毒，是可以启动外源性基因表达的强启动子；并且本研究所插入的目的基因CD和TNF-α片段小，仅有1284bp和687bp，操作简单。
本研究通过构建自杀基因CD联合细胞因子TNF—α基因共表达的非病毒载体并导入喉癌Hep-2细胞，观察CD基因和TNF—α基因共表达产物在5-FC作用下于体内外对喉癌细胞系Hep-2的杀伤作用并研究其作用机制。
研究方法：
1.构建目的基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/TNF-α-IRES—CD、pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α，并用酶切、PCR和DNA测序进行鉴定。
2.将以上各目的基因真核表达载体及pcDNA3.0(+)空白质粒在Lipofectamine2000介导下分别转染喉癌细胞Hep-2，G418筛选出抗性克隆并扩大培养，建立稳定表达株，分别命名为Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0，RT—PCR检测各目的基因的表达。
3.MTT法检测体外细胞杀伤作用。
4.MTT法检测旁观者效应。
5.流式细胞仪检测细胞凋亡率。
6.用BALB/c裸鼠构建Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四组人喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型。细胞接种的第8天(移植瘤直径约5mm)开始，每天腹腔给予5-FC，连续12天。比较给药前后肿瘤体积变化、肿瘤倍增时间及抑瘤率，通过病理切片观察组织病理变化。
7.统计学方法：采用SPSS12.0统计软件。数据以均数±标准差(-X±S)表示，用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.目的基因真核表达载体的构建及细胞转染1.1目的基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α、pcDNA3.1(+)-TNF—α—IRES—CD构建成功，经酶切、PCR和DNA测序证实各插入基因及联合基因的大小、位置、方向均正确无误。
1.2RT—PCR证明各重组外源基因在已转染目的基因真核表达载体的喉癌细胞系Hep-2中均有表达。
2.体外实验
2.1体外细胞杀伤实验Hep-2/TIC组的细胞杀伤作用最强，其杀伤作用呈浓度依赖性，与Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0组的差异均有显著性(P<0.05)。
2.2体外旁观者效应Hep-2/TIC，Hep-2/CD组细胞均显示出明显的旁观者效应，其中以Hep-2/TIC组最明显，两组间的差异有显著性(P<0.05)。而Hep-2/TNF—a和Hep-2/0组细胞未显示出旁观者效应。
2.3细胞凋亡检测Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四组细胞中以Hep-2/TIC组的凋亡率最高，四组两两之间比较差异均有显著性(P<0.05)。
3.体内实验
3.1人喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型的构建经典的皮下种植方法成功构建人喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型，细胞注射数量为5×106，成瘤率83％，成瘤时间6—8天。
3.2体内实验抑瘤作用Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四组裸鼠中，Hep-2/TIC组裸鼠移植瘤的倍增时间最长、生长速度最慢、治疗后移植瘤平均体积最小，抑瘤率达97.40％，其中有一只裸鼠移植瘤完全消除。
3.3移植瘤的组织病理学3.3.1HeF-2/TIC组：移植瘤内见大量肿瘤组织坏死，有较多淋巴细胞浸润，肿瘤细胞分裂相少见。
3.3.2Hep-2/CD组：移植瘤内见较多坏死组织及有少量淋巴细胞浸润。
3.3.3HeF-2/TNF一α组：移植瘤内见大量坏死组织及有极少淋巴细胞浸润。
3.3.4Hep-2/0组：移植瘤内见低分化鳞状细胞肿瘤组织，许多有丝分裂相的肿瘤细胞和瘤巨细胞，而肿瘤坏死及淋巴细胞浸润不明显。
结论：
1.成功构建了目的基因真核表载体pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF-α、pcDNA3.1(+)-TNF-α-IRES—CD，并通过G418筛选出稳定转染的喉癌Hep-2细胞株。
2.质粒载体pcDNA3.1(+)具有无免疫原性、安全、能稳定遗传等特点，是联合基因治疗理想的载体选择。
3.联合基因CD和TNF—α治疗喉癌，在体内、外均能明显地抑制肿瘤生长，并具有协同增强作用，是目前理想的基因治疗组合。