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(一)缺血预适应减少猪心肌缺血后无再流与内源性一氧化氮有关【目的】:观察缺血预适应对猪缺血再灌注后无再流、心肌坏死及心肌凋亡的影响,探讨作为内皮功能标志的内源性一氧化氮(NO)在其中的作用。【方法】:35只中华小型猪分为假手术组、安慰剂组、一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)组、缺血预适应组、缺血预适应联合L-NNA组。开胸冠状动脉结扎1.5小时,松解3小时制备急性心肌梗死再灌注模型。术中监测动脉血压、心室压、心率及冠脉血流量,比色法测定心肌组织一氧化氮合酶(NOS)活性;用面积求积法测定心肌的缺血、坏死及无再流范围;髓过氧化物酶(MPO)法测定心肌MPO活力;病理组织染色计数中性粒细胞浸润程度;免疫印迹法测定心肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮钙粘连素(VE-cadherin)、半胱天冬酶—3(caspase-3)含;TUNEL法检测心肌细胞凋亡发生率;在电镜下观察微血管内皮损伤情况。【结果】:L-NNA组、缺血预适应联合L-NNA处理组各有一只动物在再灌注期间因低血压死亡;在缺血前,L-NNA组收缩期动脉血压和心功能指标左室心室内压力变化率峰值(+dp/dt)明显高于安慰剂组(P＜0.05);各组血压心率乘积(RPP)及左室舒张末压无明显差异(所有P＞0.05);在再灌注期间,安慰剂组心率较假手术组增快(所有P＜0.05);再灌注180分钟时RPP和心功能指标在各组间无明显差异(P＞0.05)。假手术组(0.98±0.20 u/mg)心肌组织cNOS活性明显高于安慰剂组无再流(0.24±0.04 u/mg)和再流区(0.30±0.05 u/mg)心肌,假手术组(0.31±0.06u/mg)iNOS活性明显低于安慰剂组再流区(0.73±0.08 u/mg)和无再流区(0.90±0.14 u/mg)(所有P＜0.05);与安慰剂相比,L-NNA处理(0.13±0.04 u/mg)明显降低再流区心肌组织eNOS活性(P＜0.05);缺血预适应(0.62±0.07 u/mg,0.55±0.04 u/mg)明显增加再流区和无再流区心肌组织eNOS活性(所有P＜0.05);而缺血预适应联合L-NNA处理组eNOS活性(0.42±0.07 u/mg,0.34±0.03 u/mg)与安慰剂组无明显差异;四个缺血模型组间iNOS活性无差异(P＞0.05)。四个缺血模型组间心肌缺血面积无明显差异(P＞0.05);L-NNA组(97±3%,34.5±1.8%)心肌坏死面积、心肌凋亡指数与安慰剂组(90±3%.28.2±2.4%)无明显差异(P＞0.05),缺血预适应(78±2%,16.5±0.9%)及联合使用L-NNA(79±2%,18.6±1.7%)明显减少心肌坏死面积和心肌凋亡指数(所有P＜0.05),减少了再流区活性caspase-3蛋白含量。L-NNA(70±2%)、缺血预适应联合L-NNA(67±1%)组无再流面积与安慰剂组(70±4%)比较无明显差异;缺血预适应组无再流面积56±2%,与以上3组均有明显差异(P＜0.05);与安慰剂相比,缺血预适应减少了再流区中性粒细胞浸润程度(MPO活性0.64±0.15 vs.1.77±0.09IU/g,中性粒细胞浸润评分1.14±0.14 vs.2.00±0.31,所有P＜0.05),保护了血管内皮结构的完整性(微血管内皮超微结构损伤减轻和无再流区VE-cadherin表达增加)。而缺血预适应联合NOS抑制剂L-NNA组心肌再流区MPO活性(1.63±0.16 IU/g)、中性粒细胞浸润评分(2.00±0.26)与缺血预适应组相比明显降低(P＜0.05)。【结论】:缺血预适应减少无再流的作用与内源性NO有关,而内源性NO不是缺血预适应减少心肌坏死和凋亡的主要机制。(二)瑞舒伐他汀减少猪心肌缺血后无再流和再灌注损伤与内源性一氧化氮有关【目的】:观察瑞舒伐他汀预处理对猪缺血再灌注后无再流、心肌坏死及心肌凋亡的影响,探讨作为内皮功能标志的内源性一氧化氮(NO)在其中的作用。【方法】:35只中华小型猪随机分为假手术组、安慰剂组、一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)处理组、瑞舒伐他汀组、瑞舒伐他汀联合L-NNA组。开胸结扎冠状动脉1.5小时,松解3小时制备急性心肌梗死再灌注模型。术中监测动脉血压、心室压、心率及冠脉血流量,比色法测定心肌组织NOS活性;用面积求积法测定心肌的缺血、坏死及无再流面积;髓过氧化物酶(MPO)法测定心肌MPO活力;病理组织染色计数中性粒细胞浸润程度;免疫印迹法测定心肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮钙粘连素(VE-cadherin)、半胱天冬酶—3(caspase-3)水平;TUNEL法检测心肌细胞凋亡发生率;在电镜下观察微血管内皮损伤情况;监测瑞舒伐他汀血药浓度和血脂水平。【结果】:L-NNA组和瑞舒伐他汀联合L-NNA组各有一只动物在再灌注期间死于低血压;缺血前,L-NNA和瑞舒伐他汀联合L-NNA组收缩期动脉血压和心功能指标左心室内压力变化率峰值(+dp/dt)明显高于安慰剂组(P＜0.05);各组血压心率乘积(RPP)及左室舒张末压无明显差异(所有P＞0.05);在再灌注期间,安慰剂组心率较假手术组增快(所有P＜0.05);再灌注180分钟时,RPP和心功能指标在各组间无明显差异(所有P＞0.05)。假手术组(0.98±0.20 u/mg)心肌组织cNOS活性明显高于安慰剂组无再流(0.24±0.04 u/mg)和再流区(0.30±0.05 u/mg)心肌,假手术组(0.31±0.06u/mg)iNOS活性明显低于安慰剂组再流区(0.73±0.08 u/mg)和无再流区心肌(0.90±0.14 u/mg)(所有P＜0.05);与安慰剂相比,L-NNA处理(0.13±0.04 u/mg)明显降低再流区心肌组织eNOS活性(P＜0.05),瑞舒伐他汀(0.52±0.04 u/mg)明显增加再流区心肌组织eNOS活性(P＜0.05),而瑞舒伐他汀联合L-NNA(0.42±0.06u/mg)虽有增加eNOS活性趋势,但未达统计学差异;四个缺血模型组间iNOS活性、eNOS蛋白含量无差异。四个缺血模型组间心肌缺血面积无明显差异(P＞0.05);L-NNA组(97±3%,34.5±1.8%)心肌坏死面积、心肌凋亡指数与安慰剂(90±3%,28.2±2.4%)无明显差异(P＞0.05);与安慰剂相比,瑞舒伐他汀明显减少心肌坏死面积(79±3%)、再流区心肌凋亡(17.4±1.6%)(所有P＜0.05)和活性caspase-3蛋白含量,而联合使用L-NNA组心肌坏死面积(88±1%)和心肌凋亡(26.9±2.3%)与瑞舒伐他汀组相比明显增加(所有P＜0.05)。L-NNA(70±2%)组无再流面积与安慰剂组(70±4%)比较无明显差异(P＞0.05);与安慰剂相比,瑞舒伐他汀减少了无再流面积(54±4%),增加了再灌注180分钟时冠脉血流量,减少再流区中性粒细胞浸润程度(再流区MPO活力是0.69±0.12 vs1.77±0.09IU/g,中性粒细胞浸润评分1.00±0.14 vs 2.00±0.31,所有P＜0.05),保护了血管内皮结构的完整性(微血管超微结构损伤减轻和无再流区VE-cadherin表达增加);瑞舒伐他汀联合L-NNA组无再流面积(70±2%)、心肌再流区MPO活力(1.56±0.13 IU/g)、中性粒细胞浸润评分(1.83±0.17)、冠脉血流量等指标与瑞舒伐他汀组相比均有明显差异(所有P＜0.05)。给药后3 h和4.5 h,瑞舒伐他汀组血药浓度分别为7.53±0.55 ug/L和9.92±1.42 ug/L;瑞舒伐他汀组血浆总胆固醇和低密度脂蛋白浓度分别为1.91±0.06mmol/L和1.11±0.07)mmol/L明显低于安慰剂组2.54±0.17 mmol/L和1.63±0.17mmol/L(P＜0.05)。【结论】:瑞舒伐他汀减少心肌缺血后无再流和心肌再灌注损伤作用与内源性NO有关。常规剂量的瑞舒伐他汀服用4天就可以明显降低血脂水平。(三)通心络减少猪心肌缺血后无再流和再灌注损伤与内源性一氧化氮有关【目的】:观察中药方剂通心络对猪缺血再灌注后无再流、心肌坏死及心肌凋亡的影响,探讨作为内皮功能标志的内源性一氧化氮(NO)在其中的作用。【方法:35只中华小型猪随机分为假手术组、安慰剂组、一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)组、通心络超微粉(0.4g/kg)组和通心络联合L-NNA组。开胸结扎冠状动脉1.5小时,松解3小时制备急性心肌梗死再灌注模型。术中监测动脉血压、心室压、心率及冠脉血流量,比色法测定心肌组织NOS活性;用面秋求积法测定心肌的缺血、坏死及无再流面积;髓过氧化物酶(MPO)法测定心肌MPO活力;病理组织染色计数中性粒细胞浸润程度;免疫印迹法测定心肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮钙粘连素(VE-cadherin)、半胱灭冬酶—3(caspase-3)水平;TUNEL法检测心肌细胞凋亡发生率;在电镜下观察微血管内皮受损伤情况。【结果】:L-NNA组一只动物在再灌注期间死于低血压,通心络联合L-NNA组一只动物在缺血期间死于心室颤动;缺血前,L-NNA和通心络联合L-NNA组收缩期动脉血压和左心室内压力变化率峰值(+dp/dt)明显高于安慰剂组(P＜0.05),各组血压心率乘积(RPP)及左室舒张末压无明显差异;在缺血后再灌注期间,安慰剂较假手术组心率增快;再灌注180分钟时RPP和心功能指标在各组间无明显差异(所有P＞0.05)。假手术组(0.98±0.20 u/mg)心肌组织cNOS活性明显高于安慰剂组无再流(0.24±0.04 u/mg)和再流区(0.30±0.05 u/mg)心肌组织,假手术组(0.31±0.06u/mg)iNOS活性明显低于安慰剂组再流区(0.73±0.08 u/mg)和无再流区(0.90±0.14)u/mg)(所有P＜0.05);与安慰剂相比,L-NNA处理(0.13±0.04 u/mg)明显降低再流区心肌组织eNOS活性(P＜0.05),通心络(0.51±0.07 u/mg)明显增加再流区心肌组织eNOS活性(P＜0.05);通心络联合L-NNA处理eNOS活性(0.38±0.05 u/mg)与安慰剂相比无差异;四个缺血模型组间iNOS活性、eNOS蛋白含量无差异。四个缺血模型组间心肌缺血面积无明显差异(P＞0.05);L-NNA组(97±3%,34.5±1.8%)心肌坏死面积、心肌凋亡指数与安慰剂(90±3%,28.2±2.4%)无明显差异(P＞0.05);与安慰剂相比,通心络(78±3%)明显减少心肌坏死面积、心肌凋亡指数(15.5±2.2%)(所有P＜0.05)和活性caspase-3蛋白含量;而联合使用L-NNA组心肌坏死面积(95±3%),心肌凋亡凋亡指数(30±0.8%)与通心络组相比有明显差异(所有P＜0.05)。L-NNA(70±2%)组无再流面积与安慰剂组(70±4%)比较无明显差异;与安慰剂相比,通心络减少了无再流面积(47±5%),增加了再灌注120、180分钟时冠脉血流量,减少中性粒细胞浸润程度(心肌再流区、无再流区MPO活力分别是1.12±0.15 vs 1.77±0.09IU/g和1.30±0.11 vs 2.07±0.17IU/g,再流区中性粒细胞浸润评分0.86±0.26 vs 2.00±0.31,所有P＜0.05),保护了血管内皮结构的完整性(微血管内皮超微结构损伤减轻和无再流区VE-cadherin表达增加)。而通心络联合L-NNA组无再流面积(63±3%)、心肌再流区、无再流区MPO活力(分别是1.57±0.05和1.64±0.33 IU/g)、再流区中性粒细胞浸润评分(1.64±0.33),无再流区VE-cadherin、再灌注120和180分钟时冠脉血流量等指标,与通心络组相比有明显差异(所有P＜0.05)。【结论】:通心络减少心肌缺血再灌注损伤作用与内源性NO有关。