甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解反应中的一种非常关键的酶,在组织中表达量很高、含量较稳定,常在药物干预及基因表达调控中作为内参研究其它基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶不仅参与能量代谢,还具有DNA修复、启动细胞凋亡、调节蛋白质的表达等许多生理功能,是一种参与许多亚细胞水平活动的多功能蛋白质。为研发出成本低,抗GAPDH高亲和力与特异性广谱单克隆抗体,本研究以GAPDH cDNA为模板,通过PCR技术扩增GAPDH基因片段,连接至克隆载体pMD18-T,将重组质粒pMD18-T-GAPDH转化大肠杆菌Top1OF、中,通过扩增后提取质粒,进行酶切鉴定并回收目的片段,然后与表达载体pTO-T7连接,将重组质粒pT0-T7-GAPDH转入大肠杆菌ER2566进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后,重组菌株表达了一个约37kDa的蛋白,大小与预期目的蛋白一致。经Western blotting验证,该蛋白为GAPDH重组蛋白。重组GAPDH经硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析及分子筛层析等方法纯化,重组GAPDH蛋白纯度达到了99%,满足单克隆抗体的制备要求。采用多点皮下注射的方式,以纯化的重组GAPDH对BALB/C雌性小鼠进行免疫,采用间接ELISA检测小鼠血清效价,当血清效价达1×106后,取免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经20%FBS-HAT-1640培养基筛选杂交瘤细胞后,发现融合率和阳性率分别为81.3%和75.4%。选取阳性值高的杂交瘤细胞进行3次克隆化,最后筛选到6株能稳定性分泌抗GAPDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过小鼠腹腔注射的方式大量制备单克隆抗体,然后经Protein A亲和层析纯化后获得了6株特异性好、灵敏度高的抗GAPDH单克隆抗体,其效价达1×105,可以广泛应用于细胞生物学和免疫学试验,在农产品加工与贮藏工程及相关领域具有良好的应用前景。