【摘 要】
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由病毒引起的猪腹泻疫病流行范围广,仔猪发病率高,死亡率可高达100%。而且多病原感染、协同感染较为普遍。临床很难确定主要诱发病因,给诊断和控制带来困难。报道较多的猪腹泻病毒有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacorona virus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transm
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由病毒引起的猪腹泻疫病流行范围广,仔猪发病率高,死亡率可高达100%。而且多病原感染、协同感染较为普遍。临床很难确定主要诱发病因,给诊断和控制带来困难。报道较多的猪腹泻病毒有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacorona virus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪捷申病毒(Porcine teschvirus,PTV)、牛病毒毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)、猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)、猪嵴病毒(Porcine kobuvirus,PKoV)、猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)、猪环曲病毒(Porcine torovirus,PToV)、猪札幌病毒(Porcine Sapovirus,PSa V)等,这些病毒引起不成程度腹泻,在多个病原共同感染情况下,可导致严重腹泻及猪只死亡。Luminex液相芯片xTAG技术是荧光编码的微球作为反应载体,根据微球内荧光染料配比的不同,产生出不同的编码微球,通过把Luminex特有的TAG短序列结合到微球上,每个编码微球都可对应不同的目标物,而实现多分子同时检测的技术。以PToV M基因、PDCoV M基因、PAstV RDRP基因、PKoV 3D基因、PSV RDRP基因、PTV 3D基因、Psa V RDRP基因、BVDV 5’URT基因、PEDV M基因、TGEV N基因以及PoRV VP6基因序列为靶基因,使用DNAStar和Oligo7软件分别设计针对11种病毒的PCR引物。并进行单一PCR检测,确定引物特异性,筛选获得针对单一病毒的特异性引物。对选用的11对引物进行修饰,上游引物5’端与anti-TAG序列的3’端之间加入Spacer C12,下游引物5’端进行生物素(Biotin-)标记,修饰引物用于病毒基因扩增。PCR扩增产物与偶联有序列互补的TAG微球杂交,通过优化杂交反应条件,建立反应体系,杂交产物即可上机进行检测,根据MFI值判定检测结果,并进行定量分析。在单一检测体系的基础上,混合多个检测体系,建立Luminex xTAG多重检测方法。并不断优化条件,最终建立同时检测11种腹泻病毒的Luminex xTAG方法。最佳杂交体系以及反应条件为:20μL微球工作液、5μL的PCR扩增产物、75μLSAPE报告缓冲液;最佳杂交温度为42℃,最佳杂交时间为30min。建立的Luminex xTAG检测方法特异性试验表明,各个引物对特异性良好,引物对之间无交叉反应。该方法的最低检测线为:PTV 3.12×10~3copies/μL、PKOV 2.92×10~3copies/μL、PDCoV 2.79×10~3copies/μL、PSV 3.37×10~3copies/μL、PSa V2.7×10~3copies/μL、PAstV 3.02×10~3copies/μL、PToV 2.65×10~3copies/μL、PoRV 2.57×10~3copies/μL、PEDV 1.74×10~3copies/μL、BVDV 2.41×10~3copies/μL、TGEV 2.75×10~3copies/μL。对2017~2018上海周边地区的173份猪腹泻粪便进行检测。得出PEDV的阳性检出率最高,其次是PKoV和PAstV;PoRV的阳性检出率为14.5%、PSV的阳性检出率为6.9%、BVDV的阳性检出率为6.4%、PEDV的阳性检出率为32.4%、PKoV的阳性检出率为26.0%、PSa V的阳性检出率为11.6%、PToV的阳性检出率为2.9%、PAstV的阳性检出率为26.0%、TGEV的阳性检出率为3.5%、PDCoV的阳性检出率为0.6%、PTV的阳性检出率为1.73%。对结果统计,分析得出不同混合感染重数中的主要病毒种类,173份临床样品中存在最高7种病毒同时感染,包括PKoV、PEDV、PoRV、PAstV、PSa V、PToV与PSV。对结果定量分析,推测出PSa V、PoRV、PAstV、PToV、PEDV这五个病毒为混合感染样品的优势病毒。
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