论文部分内容阅读
目的:基于转录组测序（RNA Sequencing,RNA-Seq）技术进行原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者癌组织转录组变化的研究,筛选、验证HCC相关的基因融合现象,以寻找新的HCC分子标志物,并分析其在HCC发生发展中的潜在作用。方法:1.基于RNA-Seq技术筛选、鉴定HCC相关融合基因提取9例原发性肝细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织的总RNA,用Illumina高通量测序技术平台进行RNA-Seq,在单核苷酸水平上对每一份样本的整体转录活动进行检测。经与配对癌旁组织的比较,进行癌组织差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）的分析与基因融合的分析,筛选、鉴定HCC相关的基因融合现象,并对获得的融合基因予以Sanger测序的验证。2.融合基因扩大样本规模的验证,具复现性CRYL1-IFT88全长cDNA的获取及其生物信息学功能的分析对经RNA-Seq筛选获得的4种融合基因行扩大样本规模的RT-PCR检测与Sanger测序验证,其中融合基因CRYL1-IFT88被发现在HCC癌组织中具有复现性;通过5’及3’-cDNA末端快速增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）获取CRYL1-IFT88融合基因cDNA的全长;通过生物信息学手段分析CRYL1-IFT88的功能。结果:1.运用RNA-Seq技术筛选、鉴定HCC相关融合基因9例HCC患者癌组织及其配对癌旁组织经RNA-Seq检测,每例样本可测得35Mreads,约合4.38G每样品（4.3G-4.5G）;18例样品一共获得78.8G个碱基,平均93%（90.3%-94.5%）的reads被定位到人类参考基因组,平均覆盖深度达到31X（30-33X）,平均每例样品检测到17686个表达基因（16652-18347）,占UCSC HG19T提供的基因总数（25265种）的70%,其中表达量FPKM≥1的基因数目平均为12611种（11663-13543）,占基因总数50%。通过9例癌组织与配对癌旁组织的比较,发现组间DEG 1943个,其中在癌组织上调为690个,下调为1253个;DEG富集在细胞周期、DNA复制、p53途径、补体和凝血级联反应等10种信号途径与一些代谢通路中。在9例癌组织中共鉴定出7种基因融合包括CRYL1-IFT88、BRD9-OR4N2、MPV17-TRIM54、BHMT-MTATP6P1、NOMO3-XYLT1（chr16:16372646;chr16:17318037）、NOMO3-XYLT1（chr16:16372646;chr16:17323802）、TNFSF14-C3;经RT-PCR检测及Sanger测序法验证,其中4种融合基因验证结果与RNA-Seq结果相符,分别为:CRYL1-IFT88、BRD9-OR4N2、MPV17-TRIM54、NOMO3-XYLT1（chr16:16372646;chr16:17318037）。2.融合基因扩大样本规模的验证,具复现性CRYL1-IFT88全长cDNA的获取及其生物信息学功能的分析2.1对4种融合基因行扩大样本规模（54例）的RT-PCR检测及Sanger测序验证,结果在54例HCC患者癌组织中又发现5例CRYL1-IFT88融合基因阳性;计算CRYL1-IFT88融合基因在HCC癌组织的阳性率为9.52%（6/63）。相比CRYL1-IFT88,其余3种融合基因BRD9-OR4N2、MPV17-TRIM54、NOMO3-XYLT1（chr16:16372646;chr16:17318037）在54例HCC患者癌组织及配对癌旁组织样本的RT-PCR检测结果均为阴性。2.2经3’和5’RACE实验获得的CRYL1-IFT88融合基因cDNA全长为779bp,其中开放阅读框279bp,编码产物为92个氨基酸的蛋白。2.3生物信息学分析结果显示:CRYL1-IFT88融合蛋白分子量:9822.34,分子式:C427H701N119O133S6,等电点:5.25;CRYL1-IFT88融合蛋白功能与CRYL1接近;CRYL1与IFT88基因发生融合使IFT88结构发生改变,导致其抑癌功能被抑制。结论:1.HCC癌组织存在转录水平的高度异常,大量DEG富集在细胞周期、DNA复制、p53途径、补体和凝血级联反应等10种信号途径以及一些代谢通路中,其中细胞周期、DNA复制、p53途径、补体和凝血级联反应途径与肿瘤密切相关。HCC癌组织存在多发的基因融合现象。2.CRYL1-IFT88融合基因是存在于HCC癌组织的一种具复现性的转录本,可作为新的HCC分子标志物。CRYL1与IFT88基因发生的基因融合可能参与了HCC的发生发展进程。