【摘 要】
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目的:对肺炎克雷伯菌毒性质粒p KP20194a-p1上II型TA（Toxin–Antitoxin,TA）系统Kip TA进行鉴定,了解Kip TA在临床肺炎克雷伯菌中的分布情况,并探讨Kip TA的生物学功能。方法:1.对13株已测序的碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae,CR-hv K
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目的:对肺炎克雷伯菌毒性质粒p KP20194a-p1上II型TA（Toxin–Antitoxin,TA）系统Kip TA进行鉴定,了解Kip TA在临床肺炎克雷伯菌中的分布情况,并探讨Kip TA的生物学功能。方法:1.对13株已测序的碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae,CR-hv Kp）毒性质粒上的一对假定蛋白（暂命名为Kip T与Kip A）进行生物信息学结构分析。2.构建Kip T表达载体,诱导Kip T在异位菌（E.coli DH5α）及本体菌（NUTH-K2044）中表达,光密度(OD600)测定细菌生长情况,联合大蜡螟细菌感染实验监测Kip T对细菌生长的影响。3.构建Kip A表达载体,利用光密度(OD600)监测Kip A与Kip T共表达时细菌生长情况,探究Kip A的抗毒素作用。4.PCR检测临床分离的肺炎克雷伯菌中Kip TA的分布。5.致死剂量环丙沙星筛选持留菌,通过琼脂平板菌落克隆的形成计数持留菌的形成量。6.结晶紫半定量法测定生物膜的形成。7.多重PCR检测临床分离的肺炎克雷伯菌中19种毒力基因携带情况,比较Kip TA与毒力基因检出率的关系。结果:1.生物信息学分析发现Kip T和Kip A共用4个碱基,Kip A位于上游,以强启动子ATG启动,片段大小为444 bp,编码147个氨基酸;Kip T位于下游,以弱启动子GTG启动,片段大小为471 bp,编码156个氨基酸。Kip T与具有RES结构域毒素蛋白具有高度同源的R、E、S残基。2.成功构建Kip T原核表达载体,Kip T表达时能抑制细菌生长,大蜡螟毒性实验显示Kip T表达时可抑制NUTH-K2044在大蜡螟体内增殖（P（27）0.05）。3.成功构建Kip A原核表达载体,Kip A表达时可逆转Kip T对细菌的毒性作用（P（27）0.05）。4.Kip TA在临床肺炎克雷伯菌中的检出率高达49.38%。5.相比于未诱导组,Kip T诱导表达后,持留菌形成概率增加了86.62%（E.coli MG1655）差异有统计学意义（P（27）0.05）。6.Kip T的表达使得大肠杆菌和肺炎克雷伯菌生物膜形成的量分别增加了40.00%和62.87%,差异具有统计学意义（P（27）0.05）。7.肺炎克雷伯菌中17种毒力基因（iut A、rmp A/rmp A2、iro N、uge、ycf M、wab G、kpn、all S、ent B、wca G、mrk D、irp-2、aerobactin、irp-1、ybt S、ure A）检出率与Kip TA的检出率呈正相关（P（27）0.05）;Kip TA阳性组中hv Kp的检出率为86.08%,高于Kip TA阴性组（32.92%）（P（27）0.05）;结论:1.Kip TA是肺炎克雷伯菌毒性质粒上新发现的一对II型TA系统。2.Kip TA在临床肺炎克雷伯菌中分布广泛。3.Kip TA参与持留菌和生物被膜的形成,且与肺炎克雷伯菌毒力基因存在相关。
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