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胰腺癌是目前最致命的恶性肿瘤之一,5年生存率仅为9%,是全球癌症相关死亡的第七大主要原因。胰腺癌的传统治疗方法包括手术切除、放疗和化疗等,但临床上患者易复发、易耐药。此外,由于胰腺癌的免疫原性较低,现有的免疫检查点阻断剂等免疫治疗效果并不理想,因此亟需寻找新的更有效的治疗策略。重组免疫毒素（recombinant immunotoxin,RIT）是将抗体可变区和细菌外毒素融合表达的重组蛋白,结合了抗体的特异性和毒素的强大杀伤作用,是新型的抗肿瘤靶向药物。基于铜绿假单胞菌外毒素（Pseudomonas Exotoxin A,PE）的免疫毒素能有效抑制肿瘤细胞的蛋白合成,诱导细胞凋亡,其作用机制不同于临床上其它抗肿瘤药物,可有效克服胰腺癌患者的化疗耐药性。本研究中,我们针对两种不同的胰腺癌相关抗原,间皮素（mesothelin,MSLN）和Glypican-1（GPC1）,分别筛选了高亲和力、高特异性抗体,将其与免疫原性更低的截短体PE（称为LR）偶联,制备了基于LR的免疫毒素,并进行体内、外抗肿瘤活性研究。1.靶向GPC1免疫毒素的制备和抗肿瘤活性研究Glypican-1（GPC1）是一种细胞膜表面糖蛋白,由人类Gpc1基因编码,共有558个氨基酸,预测分子量为62 k Da。GPC1是glypicans家族成员,由核心蛋白（core protein）和3条硫酸肝素链（Heparan Sulfate,HS）构成,并通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚定到细胞表面。GPC1在胰腺癌细胞中过表达,促进胰腺癌的增殖和迁移,且GPC1高表达与胰腺癌患者的不良预后密切相关,是潜在的胰腺癌临床诊断和治疗的生物标志物。靶向GPC1免疫毒素的研究未见报道,本课题旨在探究GPC1能否成为免疫毒素治疗胰腺癌的靶点,并开展了如下研究工作。首先通过噬菌体展示技术和杂交瘤技术筛选得到靶向GPC1的骆驼单域抗体D4、人重链单域抗体h VH、鲨鱼单域抗体A1和小鼠单克隆抗体HM2。我们将上述抗体序列克隆至免疫毒素表达载体中,经发酵、包涵体制备、体外变性、复性、阴离子交换层析和分子筛层析纯化后,成功制备了抗GPC1免疫毒素D4-LR,h VH-LR,A1-LR和HM2-LR。其中,D4-LR和HM2-LR纯度好、产量高、亲和力强,在体外能特异性高效杀伤GPC1过表达肿瘤细胞H8/A431和2B9/KLM1。为了进一步提高D4-LR的细胞毒性,我们通过基因工程改造将其构建成了双价免疫毒素D4-AAA-D4-LR和D4-GGS-D4-LR。相比于D4-LR,双价免疫毒素的亲和力提高近70倍,在天然胰腺癌细胞T3M4和KLM1上呈现更好的细胞增殖抑制活性。我们进一步构建了小鼠异种移植肿瘤模型,并在体内评价抗GPC1免疫毒素的抗肿瘤活性。结果表明,HM2-LR,D4-LR和D4-AAA-D4-LR在H8/A431皮下荷瘤小鼠模型和T3M4腹腔移植小鼠模型上均能明显抑制肿瘤生长,并显著延长小鼠生存期。这些数据证明,GPC1可以成为免疫毒素的作用靶点用于胰腺癌的治疗。2.靶向MSLN免疫毒素的制备和抗肿瘤活性研究间皮素（mesothelin,MSLN）也是一种细胞膜表面糖蛋白,预测分子量为40 k Da,通过GPI锚定在细胞表面。MSLN是肿瘤特异性抗原,限制性表达在胸膜、心包和腹膜的正常间皮细胞上,但在多种实体瘤（包括胰腺癌）表面过表达,促进癌细胞增殖、局部浸润和转移,并增强癌细胞抗凋亡能力。MSLN在胰腺癌的恶性转化和侵袭性中发挥着重要作用,其高表达与胰腺癌患者的不良预后相关。两个靶向MSLN的免疫毒素（SS1P和LMB-100）正在进行临床试验。本研究旨在筛选靶向MSLN的骆驼单域抗体（又称“纳米抗体”）,构建成纳米抗体免疫毒素并对其进行表征和活性鉴定。相比于临床上正在使用的免疫毒素,纳米抗体免疫毒素分子量更小、组织渗透性更强,有望成为更好的抗胰腺癌免疫毒素。我们通过噬菌体展示技术筛选得到4个靶向MSLN的纳米抗体A101,G8,G11和A6,将其制备成相应的抗MSLN免疫毒素。通过抗原结合活性、热稳定性、ADP-ribosylation和体外细胞增殖抑制活性检测等,筛选出活性高、稳定性好的A101-LR。为了获得更好的细胞毒性,我们将A101-LR进行基因工程优化构建成双价免疫毒素A101-AAA-A101-LR。相比于A101-LR,A101-AAA-A101-LR热稳定性保持不变,亲和力提高近10倍,且在MSLN过表达细胞H9/A431（18倍）、天然胰腺癌细胞T3M4（3倍）、KLM1（8倍）上显示出更好的增殖抑制活性。3.靶向GPC1/MSLN双特异性免疫毒素的制备和抗肿瘤活性研究胰腺癌细胞表面共表达GPC1和MSLN,同时靶向GPC1和MSLN的双特异性免疫毒素可能具有更好的协同抗肿瘤活性。我们采用G9S8短肽将D4和A101单域抗体连接起来,与LR偶联制备成双特异性免疫毒素D4/A101-LR和A101/D4-LR。ELISA、流式细胞术和Octet结果表明双特异性免疫毒素基本保留了各个抗体结合各自抗原的能力,且能同时结合GPC1和MSLN,在双阳性细胞2G2/A431上呈现显著增强的增殖抑制活性(IC50=0.09n M)。相比于D4-LR和A101-LR,双特异性免疫毒素在胰腺癌细胞T3M4和KLM1上也展现出更好的抗肿瘤活性。综上所述,本研究的目的在于构建抗胰腺癌免疫毒素用于胰腺癌治疗。纯化的抗GPC1或MSLN的免疫毒素纯度高、特异性好,能有效抑制胰腺癌细胞增殖。此外,基因工程改造的双价免疫毒素亲和力更高,体外抗肿瘤活性更强。双特异性免疫毒素能同时结合GPC1和MSLN,在双阳性肿瘤细胞上呈现更好的增殖抑制活性。抗GPC1免疫毒素在胰腺癌异种移植小鼠模型上能明显抑制肿瘤生长,显著延长小鼠的生存期。本课题制备的抗胰腺癌免疫毒素为胰腺癌的治疗提供了新的思路和方向,值得进一步进行临床前和临床研究。